手性色譜柱（Chiral HPLC Columns）是由具有光學(xué)活性的單體，固定在硅膠或其它聚合物上制成手性固定相（Chiral Stationary Phases）。通過引入手性環(huán)境使對映異構(gòu)體間呈現(xiàn)物理特征的差異，從而達(dá)到光學(xué)異構(gòu)體拆分的目的。要實(shí)現(xiàn)手性識(shí)別，手性化合物分子與手性固定相之間至少存在三種相互作用。這種相互作用包括氫鍵、偶級-偶級作用、π-π作用、靜電作用、疏水作用或空間作用。手性分離效果是多種相互作用共同作用的結(jié)果。這些相互作用通過影響包埋復(fù)合物的形成，特殊位點(diǎn)與分析物的鍵合等而改變手性分離結(jié)果。由于這種作用力較微弱，因此需要仔細(xì)調(diào)節(jié)、優(yōu)化流動(dòng)相和溫度以達(dá)到最佳分離效果。。
在手性拆分中，溫度的影響是很顯著的。低溫增加手性識(shí)別能力，但可能引起色譜峰變寬而導(dǎo)致分離變差。因此確定手性分析方法過程中要考慮柱溫的影響，確定最優(yōu)柱溫。

    迄今為止，尚沒有一種類似十八烷基鍵合硅膠（ODS）柱的普遍適用的手性柱。不同化學(xué)性質(zhì)的異構(gòu)體不得不采用不同類型的手性柱，而市售的手性色譜柱通常價(jià)格昂貴，因此如何根據(jù)化合物的分子結(jié)構(gòu)選擇適用的手性色譜柱是非常重要的。
根據(jù)手性固定相和溶劑的相互作用機(jī)制，Irving Wainer首次提出了手性色譜柱的分類體系：

第1類：通過氫鍵、π-π作用、偶級-偶級作用形成復(fù)合物。

第2類：既有類型1中的相互作用，又存在包埋復(fù)合物。此類手性色譜柱中典型的是由纖維素及其衍生物制成的手性色譜柱。

第3類：基于溶劑進(jìn)入手性空穴形成包埋復(fù)合物。這類手性色譜柱中最典型的是由Armstrong教授開發(fā)的環(huán)糊精型手性柱[2]，另外冠醚型手性柱和螺旋型聚合物，如聚（苯基甲基甲基丙烯酸酯）形成的手性色譜柱也屬于此類。

    第4類：基于形成非對映體的金屬絡(luò)合物，是由Davankov開發(fā)的手性分離技術(shù)，也稱為手性配位交換色譜（CLEC）。

    第5類：蛋白質(zhì)型手性色譜柱。手性分離是基于疏水相互作用和極性相互作用實(shí)現(xiàn)。
但由于市場上可選擇的手性色譜柱越來越多，此分類系統(tǒng)有時(shí)很難將一些手性柱歸納進(jìn)去。因此參考Irving Wainer的分類方法，根據(jù)固定相的化學(xué)結(jié)構(gòu)，將手性色譜柱分為以下幾種：

    刷（Brush）型或稱為Prikle型

    纖維素（Cellulose）型

    環(huán)糊精（Cyclodextrin）型

    大環(huán)抗生素（Macrocyclic antibiotics）型

    蛋白質(zhì)（Protein）型

    配位交換（|Ligand exchange）型

    冠醚（Crown ethers）型

    刷型：
 
   刷型手性色譜柱的出現(xiàn)和發(fā)展源于Bill Prikle及其同事的卓越工作。六十年代，Bill Prikle將手性核磁共振中的成果運(yùn)用到手性HPLC固定相研究中，通過不斷實(shí)踐，發(fā)明了應(yīng)用范圍較廣、柱效很好的手性色譜柱。

    刷型手性色譜柱是根據(jù)三點(diǎn)識(shí)別模式設(shè)計(jì)的，屬于Irving Wainer分類中的第一種類型。

    刷型手性固定相分為π電子接受型和π電子提供型兩類。最常見的π電子接受型固定相是由（R）-N-3，5-二硝基苯甲酰苯基甘氨酸鍵合到γ-氨丙基硅膠上的制成。此類刷型手性色譜柱可以分離許多可提供π電子的芳香族化合物，或用氯化萘酚等對化合物進(jìn)行衍生化后進(jìn)行手性分離。

    π電子供給型固定相常見的是共價(jià)結(jié)合到硅膠上的萘基氨基酸衍生物，這種固定相要求被分析物具有π電子接受基團(tuán)，例如二硝基苯甲�；�。醇類、羧酸類、胺類等，可以用氯化二硝基苯甲酰、異腈酸鹽、或二硝基苯胺等進(jìn)行衍生化后，用π電子供給型固定相達(dá)到手性分離。

    刷型固定相的優(yōu)勢在于其易于合成。合成方法在Bill Prikle的著作中有詳細(xì)的說明。另外，刷型固定相具有高的容量因子，因此具有高的選擇因子。它的不利之處在于它僅對芳香族化合物有效，有時(shí)不得不進(jìn)行衍生化反應(yīng)。但值得一提的是，這種衍生化反應(yīng)是非手性衍生反應(yīng)，所以不存在手性衍生的問題。刷型手性色譜使用的流動(dòng)相基本是極性弱的有機(jī)溶劑，這對于制備色譜來講未必是缺點(diǎn)。

    近來，刷型固定相出現(xiàn)了π電子供給和接受基因的混合固定相。如：WHELK-O和BLAMO，及α-BURKE-Ⅱ固定相。α-BURKE-Ⅱ相十分適用于β-阻斷劑的手性分離。典型的流動(dòng)相為二氯甲烷-乙醇-甲醇混合物，比例為85：10：5。加入10mM醋酸銨可以調(diào)整保留時(shí)間。SS BLAMO Ⅱ，同時(shí)具有π電子供體區(qū)和受體區(qū)，形成手性裂縫，因此對于某些分子具有很高選擇性。

纖維素型：

    纖維素型手性色譜柱的分離作用包括相互吸引的作用及形成包埋復(fù)合物。它們屬于Wainer分類中的第2種類型。市售的手性色譜柱為微晶三醋酸基、三安息香酸基、三苯基氨基酸鹽纖維素固定相。很多化合物可通過此類型的色譜柱得到分離。這種類型的手性色譜柱種類也很齊全。流動(dòng)相使用低極性溶劑，典型的流動(dòng)相為乙醇-己烷混合物。但特別要注意由于氯可以使纖維素從硅膠上脫落，因此要確保流動(dòng)相中無含氯溶劑。

    這種類型的手性色譜柱主要的制造商之一是日本的Daicel公司，他們生產(chǎn)的纖維素酯和氨基甲酸纖維素柱可以分離多種生物堿和藥物。特別值得一提的是OD柱。在某手性化合物異構(gòu)體的分離中，分離度超過了25，這意味著載樣量可以很高，對于制備十分有利。
纖維素固定相的每個(gè)單元都為螺旋型，而且這種螺旋結(jié)構(gòu)還存在極性作用、π-π作用及形成包埋復(fù)合物等手性分離因素。淀粉代替纖維素制成的此類手性柱顯示了和纖維素柱不同的選擇性，但是穩(wěn)定性較差。因?yàn)榈矸凼撬�溶性的，因此流�?dòng)相中必須絕對無水才能保證柱子壽命。目前此類型的柱子能分離80%左右可能面臨到的所有手性化合物。此類柱子通常用于正相系統(tǒng)，用正己烷-乙醇，正己烷-異丙醇混合溶劑為流動(dòng)相。OD柱也可用于反相的情況，但流動(dòng)相必須含有高濃度的高氯酸鹽緩沖液，以防止固定相溶解。即使這樣，使用較長時(shí)間以后色譜柱也難免要受到損害，但是在某些情況下使用反相系統(tǒng)分離效果要優(yōu)于使用正相系統(tǒng)。

    環(huán)糊精型：

    環(huán)糊精是通過Bacillus Macerans 淀粉酶或環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶水解淀粉得到的環(huán)型低聚糖。通過控制環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶的水解反應(yīng)條件可得到不同尺寸的環(huán)糊精。市售的環(huán)糊精主要是α、β、γ三種類型，分別含6、7、8個(gè)吡喃葡萄糖單元。環(huán)糊精分子成錐筒型，構(gòu)成一個(gè)洞穴，洞穴的孔徑由構(gòu)成環(huán)糊精的吡喃葡萄糖的數(shù)目決定。環(huán)糊精類型及洞穴的孔徑等見下表：

    環(huán)糊精 糖元數(shù)目 洞穴孔徑 可進(jìn)入洞穴的分子類型 手性中心數(shù)目

    α 6 4.5-6.0 5-6元環(huán)的芳香族化合物 30

    β 7 6.0-8.0 聯(lián)苯或萘 35

    γ 8 8.0-10.0 取代芘和類固醇 40

    2，3位仲羥基分布在環(huán)糊精洞口，6位伯羥基在環(huán)糊精分子的外部，這意味著洞穴內(nèi)部是相對疏水的區(qū)域。用環(huán)糊精手性固定相產(chǎn)生手性識(shí)別要求被拆分物的疏水部分能嵌入環(huán)糊精洞穴中，形成可逆的、穩(wěn)定性不同的包合物，環(huán)糊精洞口的羥基和被拆分物的極性基團(tuán)相互作用。

    由于形成包合物速度較慢，因此可能導(dǎo)致色譜峰峰形較差，同樣也影響了其在制備色譜中的應(yīng)用。環(huán)糊精固定相的選擇性取決分析物的分子大小；α-環(huán)糊精只能允許單苯基或萘基進(jìn)入，β-環(huán)糊精允許萘基及多取代的苯基進(jìn)入，γ-環(huán)糊精僅用于大分子萜類。β-環(huán)糊精手性固定相應(yīng)用范圍最廣。Ibuprofen通過β-環(huán)糊精色譜柱得到分離，說明了pH值對氫鍵的影響。當(dāng)流動(dòng)相的pH=7時(shí)，觀察不到拆分的跡象。pH=4時(shí)，可達(dá)到好的分離效果。通常分離氨基酸時(shí)，常采用低的pH值，以抑制酸性基團(tuán)的離子化，同時(shí)也增強(qiáng)氨基的質(zhì)子化。磷酸三乙胺鹽、乙酸三乙胺鹽證明對β-環(huán)糊精色譜柱來說是很好的緩沖液。通常緩沖液是0.1%三乙胺溶液，用磷酸或醋酸調(diào)節(jié)到合適的pH值。高的流速會(huì)降低形成復(fù)合物的能力，低流速分離效果較好，0.5-1ml/min的流速最好。另外，增加緩沖液的濃度可以克服流速的影響，因?yàn)樗�可以增加環(huán)糊精洞穴和流動(dòng)相的吸引力。
常用緩沖液及其使用濃度如下表所示：

    緩沖液 濃度 目的

    TEAA（乙酸三乙胺鹽） 0.01-2% NH4NO3 10-500mM (用于減小包埋)

    檸檬酸鹽 10-200mM (特別適合于酸性化合物)

    醋酸銨 10-200mM

    pH值選擇見下表:

    醇和胺 pH4(加強(qiáng)NH的離子化)   酸 pH7

    優(yōu)化手性分離條件要考慮的方面有：pH值對分離度的影響；流速對分離度的影響；柱溫、有機(jī)相比例、緩沖鹽濃度對分離度的影響。

    環(huán)糊精的修飾：最近，對環(huán)糊精的修飾使環(huán)糊精型手性色譜柱可以分離更多的化合物，并可用于氣相手性色譜分離。衍生化是通過將不同的基因鍵合到環(huán)糊精洞穴表面的羥基上。衍生化反應(yīng)包括乙基化、S-羥基丙基化、生成S或R-萘基乙基氨基甲酸鹽、3，5二甲基苯基氨基甲酸鹽和環(huán)狀對甲苯酰酯。這些新型的環(huán)糊精固定相有許多優(yōu)點(diǎn)，它們可以分離更多化合物，價(jià)格上也有競爭力，由于改進(jìn)了手性識(shí)別能力使其更適用于制備色譜。

    配位交換型：

    手性配位交換色譜（Chiral Ligand Exchange Chromatography，CLEC）由Davankov發(fā)明，是通過形成光學(xué)活性的金屬絡(luò)合物而達(dá)到手性分離，屬于Irving Wainer分類中的第4類手性固定相，主要用于分離氨基酸類。
由于此類固定相是由手性氨基酸—銅離子絡(luò)合物鍵合到硅膠或聚合物上形成，因此流動(dòng)相中必須含有銅離子以保證手性固定相上的銅離子不至流失。其它的過渡金屬元素也已用于手性配位交換色譜，但銅離子應(yīng)用最廣。形成絡(luò)合物的過程十分緩慢，因此有時(shí)需提高柱溫，最佳溫度約50℃。
手性配位交換色譜僅對α- 氨基酸和其類似物有效。β- 氨基酸很難用手性配位交換色譜得以分離。手性配位交換色譜可用于制備，由于流動(dòng)相中存在銅離子，雖然銅離子能用離子交換柱除去，但增加了樣品處理的困難。

    大環(huán)抗生素型：

    大環(huán)抗生素型手性色譜柱是最近發(fā)展起來的，通過將大環(huán)抗生素鍵合到硅膠上制成的新型手性色譜柱。大環(huán)抗生素型手性色譜柱的出現(xiàn)歸功于Dan Armstrong的貢獻(xiàn)。此類色譜柱常用的大環(huán)抗生素主要由三種：利福霉素（Rifamycin），萬古霉素（Vancomycin），替考拉寧（Ticoplanin）。利福霉素作為手性添加劑在毛細(xì)管電泳分離手性化合物方面得到了成功運(yùn)用。萬古霉素和替考拉寧分子結(jié)構(gòu)中存在“杯”狀結(jié)構(gòu)區(qū)和糖“平面” 結(jié)構(gòu)區(qū)。此類色譜柱性質(zhì)穩(wěn)定，可用于多種分離模式。手性分離基于氫鍵、π-π作用、形成包合物、離子作用和肽鍵等。

    替考拉寧分子量為1885，結(jié)構(gòu)中存在20個(gè)手性中心，3個(gè)糖基和4個(gè)環(huán)。酸性基團(tuán)在多肽“杯”/ “裂層”的一端，堿性基團(tuán)在它的另一端。酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)提供了離子作用點(diǎn)。糖基在三個(gè)平面上，可折疊起來將化合物分子包埋在多肽“杯”中。

    萬古霉素分子量為1449，結(jié)構(gòu)中存在18個(gè)手性中心，3個(gè)環(huán)。萬古霉素具有“籃狀”結(jié)構(gòu)，它的附近還有一個(gè)可彎曲的糖平面，可將分析物分子包埋在“籃子”中。羧基和仲氨基分布在“籃子”的邊緣，參與和分析物分子產(chǎn)生離子作用。萬古霉素手性色譜柱可用于反相模式、正相模式和極性模式。萬古霉素手性色譜柱可以分離胺類、中性酰胺、脂類。但對于酸性化合物選擇性較低。在反相模式中，有機(jī)相常用四氫呋喃、乙腈和甲醇。水相常用三乙胺-乙酸緩沖液。色譜柱適用的pH范圍為4-7。通常優(yōu)化堿性化合物手性分離條件時(shí)，選擇pH=7 為起點(diǎn)比較好。另外四氫呋喃、乙腈有最好的選擇性。有時(shí)采用純的甲醇和乙醇作流動(dòng)相也可達(dá)到好的分離效果。萬古霉素手性色譜柱也可用正相模式，采用正己烷/乙醇為流動(dòng)相。
萬古霉素手性色譜柱載樣量可以很大，非常適用于制備色譜。

    蛋白質(zhì)型：

    蛋白質(zhì)型手性色譜柱屬于第5種類型。分離依賴于疏水相互作用和極性相互作用。已經(jīng)有多種蛋白質(zhì)用于此類手性色譜柱。目前使用較多的是α-酸性糖蛋白（α-Acid Glycoprotein，AGP），人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA），牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）和卵類粘蛋白（Ovomucoid，OV）。
α-酸性糖蛋白分子由181個(gè)氨基酸殘基和40個(gè)唾液酸（sialic acid） 殘基構(gòu)成。α-酸性糖蛋白分子偏酸性，等電點(diǎn)為2.7。含有兩個(gè)二硫鍵，性質(zhì)很穩(wěn)定。α-酸性糖蛋白分子可以共價(jià)鍵合到硅膠上，制成手性色譜柱，可以分離許多化合物。

    α-酸性糖蛋白手性色譜柱使用的流動(dòng)相通常為pH 4-7的磷酸鹽緩沖液和很小比例的有機(jī)相。有機(jī)相首選異丙醇，如達(dá)不到分離要求，可以嘗試乙腈，乙醇，甲醇或四氫呋喃。有機(jī)相的改變導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生暫時(shí)的改變。色譜柱的負(fù)載量至關(guān)重要，典型的負(fù)載量為0.02mg/ml的濃度樣品，進(jìn)樣20μl。pH 的改變對手性選擇性起關(guān)鍵作用，尤其是胺類化合物。pH降低導(dǎo)致蛋白質(zhì)負(fù)電荷的降低，引起胺類化合物保留時(shí)間減小，然而這意味著可以減小有機(jī)相比例，使選擇性增加，峰形改善。

    通過調(diào)節(jié)有機(jī)相比例仍無法達(dá)到分離效果時(shí)，有時(shí)需用電荷調(diào)節(jié)劑。但這可能引起蛋白結(jié)構(gòu)的永久改變，這些電荷調(diào)節(jié)劑包括丁酸、辛酸、癸酸和二甲基辛胺。有時(shí)也用到1，2 亞乙基二醇，1，2丁醇和氯化鈉。溫度對分離也有影響，溫度增加保留時(shí)間，減小分離因子。
人血清白蛋白（HSA）分子量為69,000，等電點(diǎn)為4.8。蛋白中認(rèn)為存在兩個(gè)藥物結(jié)合位點(diǎn)：華法令-氮雜普魯帕宗（warfarin-azapropazone） 和苯基二氮雜-吲哚（benzodiazapine-indole）結(jié)合位點(diǎn)。流動(dòng)相中加入辛酸，采用人血清白蛋白手性色譜柱可以有效分離benzodiazapine。Warfarin 和oxazepam也用人血清白蛋白手性色譜柱得到了分離，流動(dòng)相組成為：100mM磷酸緩沖液pH7：乙腈：異丙醇 = 84：10：6。

    牛血清白蛋白（BSA）為球型蛋白，分子量為66,000，等電點(diǎn)為4.7。此蛋白為一個(gè)單氨基酸鏈，通過17個(gè)二硫鍵形成9個(gè)雙環(huán)。許多化合物通過牛血清白蛋白手性色譜柱得到分離。牛血清白蛋白不如α-酸性糖蛋白穩(wěn)定，一些有機(jī)溶劑（如乙腈、甲醇）可使蛋白變性，因此使用起來要特別注意。

    卵類粘蛋白由蛋清中提取，分子量為55,000。它可分離大量的胺類和酸類化合物。

    蛋白手性色譜柱的載樣量均較小。影響了蛋白手性色譜柱在制備色譜中的應(yīng)用。

    蛋白手性色譜柱在所有手性色譜柱中是應(yīng)用最廣的色譜柱，但并不是效果最好的色譜柱。

    冠醚型：
    冠醚類固定相用于分離一級胺，一級胺必須質(zhì)子化方能達(dá)到分離。因此必須使用酸性流動(dòng)相，如高氯酸。最常用的是冠醚類固定相是18-冠-6，已有商品化產(chǎn)品，由Daicel公司制造。無論（+）或（-）型均可達(dá)到有效分離，并可通過變化（+）（-）類型而改變分析物出峰順序。冠醚作為添加劑也用于核磁共振和電泳，但由于其毒性較大，有致癌性，使其應(yīng)用受到限制。