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1、 一抗從4度拿出后，為什么要進行37度復(fù)溫？
（1）一方面，防止切片從4度直接放入PBS易脫片；
（2）另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要，但對表達較弱的抗原可能有用，4度和37度時分子運動方式不同，前者分子碰撞機率和運動速度小于后者，后者結(jié)合更快，但敏感性也提高了并易造成非特異染色。
（3）其實，我更贊同后一種說法，因為我嘗試把肝臟或睪丸片子從4度過夜拿出后，直接用PBS洗沒發(fā)生過脫片現(xiàn)象。
2、切片染色后背景太深，如何區(qū)分特異性與非特異性著色？
全片著色是指整個切片全都染上了顏色，著色的強度可深可淺，總之，分不清那些組織是陽性那些組織是陰性。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有：
（1）抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對其工作濃度進行測試，使每一抗體個體化，找到適合自己實驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡單的按說明書進行染色。
（2）抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，最好隨身佩帶報時表或報時鐘，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長�，F(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統(tǒng)的1小時，而是30分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進行調(diào)整。
（3）DAB變質(zhì)和顯色時間太長：DAB最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進行過濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時間太長，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控，達到理想的染色程度時立即終止反應(yīng)。不過當(dāng)染色片太多時或用染色機時，這樣做似乎不現(xiàn)實，但至少應(yīng)對一些新的或少用的抗體顯色時進行監(jiān)控，避免顯色時間過長。
（4）組織變干：修復(fù)液溢出后未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認真仔細，采用DAKO筆或PAP Pen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。
（5）切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時間太長（大于24小時）：原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。有的實驗室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù)，第二天加抗體進行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在4oC冰箱過夜，對結(jié)果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會出現(xiàn)背景著色，因此，不可存放時間太長。
（6）一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買的抗體時最好設(shè)立陽性對照和用使用過的抗體作比較。
3、脫片產(chǎn)生的原因有哪些？
（1）多聚賴氨酸玻片質(zhì)量的問題。我原先是買的，邁新按說也是不錯的，可是都脫成什么樣子了。后面補做第二批時用的病理科老師自己做的片子，要好一點。
（2）組織切的不好，切片機的問題例如比較老的舊的機器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。
（3）沒烤好，時間短，溫度不夠之類。
（4）操作的時候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水。
（5）修復(fù)的問題：抗原修復(fù)的時候高壓時間過長了，或者放進100度的修復(fù)液時手法不好，咚的一聲就丟進去了，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修復(fù)比檸檬酸容易脫片，但是你要用到EDTA的時候也沒辦法，只有從另外的問題上著手。
（6）一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹慎，用PBS的時候盡量用泡的，不要沖。基本上把這些方面都注意到了，能改善的盡量改善，脫片可以減少很多。
（7）組織的問題，我用的組織癌癥的很多，越是癌癥組織有壞死之類越容易脫。
4、免疫組化中抗原修復(fù)的最佳條件是什么？（尤其是微波修復(fù)）
關(guān)于抗原修復(fù)，我試過的修復(fù)條件有EDTA熱修復(fù)，檸檬酸鈉為緩沖液的微波修復(fù)以及高壓鍋修復(fù)。從我的實驗結(jié)果來看，微波修復(fù)其實很不容易掉片子的，而EDTA熱修復(fù)和高壓鍋修復(fù)是很容易掉片子的。因為掉片子主要是因為加熱過程中產(chǎn)生的氣泡所引起，而微波修復(fù)水加熱到沸騰，沾在片子上的氣泡就會少，不會因為小氣泡上串引起脫片。做EDTA修復(fù)時，你可以將片子靠的盡量近些，或是在載玻片四周墊些棉花什么的，然后蓋上蓋玻片，這樣修復(fù)的話就能夠盡量減少載玻片上小氣泡的形成。我們用的微波修復(fù)條件為：2.94g檸檬酸三鈉溶于1000ml的水，調(diào)PH值至6.0，微波修復(fù)10分鐘。你可以試試，時間可以根據(jù)需要自己調(diào)整。對于檸檬酸修復(fù)來說，只要高壓修復(fù)時間控制在加閥冒氣后90秒，冷水下終止開高壓鍋蓋，高壓修復(fù)和微波修復(fù)一樣不掉片子，而且一般高壓修復(fù)效果往往更好一點；關(guān)于EDTA熱修復(fù)，一般說明書上都講的是PH值等于9，實際上我試過，如果單傳用EDTA，很容易掉片子，但是用Tris-EDTA,一般就不會掉片子了，Tris-base的濃度為0.05mmol/L,高壓和微波修復(fù)都可以，PH也等于9。
5、DAB顯色后發(fā)現(xiàn)切片著色不均勻：如一片著色，一片不著色或染色淺？
著色不均勻可能與你的實驗手法有很大關(guān)系，可能原因有：
（1）切出的片子厚度本身可能就不一樣，切出一片厚，一片薄，這樣可能造成著色深淺不一。
（2）有可能是你的顯色液底物加到片子上后沒有搖勻，造成局部底物濃度不一致，所以加完顯色液后最好將片子來回左右晃動幾下，使片子上所有區(qū)域的底物濃度一致。
（3）如果你的片子是中間的染色深，靠近邊上的淺，那有可能是你蠟圈畫的太小，顯色液覆蓋的面積不過大而產(chǎn)生了邊緣效應(yīng)。最外側(cè)的組織片最好離顯色液外緣0.5cm。
（1）一方面，防止切片從4度直接放入PBS易脫片；
（2）另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要，但對表達較弱的抗原可能有用，4度和37度時分子運動方式不同，前者分子碰撞機率和運動速度小于后者，后者結(jié)合更快，但敏感性也提高了并易造成非特異染色。
（3）其實，我更贊同后一種說法，因為我嘗試把肝臟或睪丸片子從4度過夜拿出后，直接用PBS洗沒發(fā)生過脫片現(xiàn)象。
2、切片染色后背景太深，如何區(qū)分特異性與非特異性著色？
全片著色是指整個切片全都染上了顏色，著色的強度可深可淺，總之，分不清那些組織是陽性那些組織是陰性。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有：
（1）抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對其工作濃度進行測試，使每一抗體個體化，找到適合自己實驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡單的按說明書進行染色。
（2）抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，最好隨身佩帶報時表或報時鐘，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長�，F(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統(tǒng)的1小時，而是30分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進行調(diào)整。
（3）DAB變質(zhì)和顯色時間太長：DAB最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進行過濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時間太長，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控，達到理想的染色程度時立即終止反應(yīng)。不過當(dāng)染色片太多時或用染色機時，這樣做似乎不現(xiàn)實，但至少應(yīng)對一些新的或少用的抗體顯色時進行監(jiān)控，避免顯色時間過長。
（4）組織變干：修復(fù)液溢出后未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認真仔細，采用DAKO筆或PAP Pen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。
（5）切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時間太長（大于24小時）：原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。有的實驗室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù)，第二天加抗體進行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在4oC冰箱過夜，對結(jié)果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會出現(xiàn)背景著色，因此，不可存放時間太長。
（6）一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買的抗體時最好設(shè)立陽性對照和用使用過的抗體作比較。
3、脫片產(chǎn)生的原因有哪些？
（1）多聚賴氨酸玻片質(zhì)量的問題。我原先是買的，邁新按說也是不錯的，可是都脫成什么樣子了。后面補做第二批時用的病理科老師自己做的片子，要好一點。
（2）組織切的不好，切片機的問題例如比較老的舊的機器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。
（3）沒烤好，時間短，溫度不夠之類。
（4）操作的時候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水。
（5）修復(fù)的問題：抗原修復(fù)的時候高壓時間過長了，或者放進100度的修復(fù)液時手法不好，咚的一聲就丟進去了，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修復(fù)比檸檬酸容易脫片，但是你要用到EDTA的時候也沒辦法，只有從另外的問題上著手。
（6）一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹慎，用PBS的時候盡量用泡的，不要沖。基本上把這些方面都注意到了，能改善的盡量改善，脫片可以減少很多。
（7）組織的問題，我用的組織癌癥的很多，越是癌癥組織有壞死之類越容易脫。
4、免疫組化中抗原修復(fù)的最佳條件是什么？（尤其是微波修復(fù)）
關(guān)于抗原修復(fù)，我試過的修復(fù)條件有EDTA熱修復(fù)，檸檬酸鈉為緩沖液的微波修復(fù)以及高壓鍋修復(fù)。從我的實驗結(jié)果來看，微波修復(fù)其實很不容易掉片子的，而EDTA熱修復(fù)和高壓鍋修復(fù)是很容易掉片子的。因為掉片子主要是因為加熱過程中產(chǎn)生的氣泡所引起，而微波修復(fù)水加熱到沸騰，沾在片子上的氣泡就會少，不會因為小氣泡上串引起脫片。做EDTA修復(fù)時，你可以將片子靠的盡量近些，或是在載玻片四周墊些棉花什么的，然后蓋上蓋玻片，這樣修復(fù)的話就能夠盡量減少載玻片上小氣泡的形成。我們用的微波修復(fù)條件為：2.94g檸檬酸三鈉溶于1000ml的水，調(diào)PH值至6.0，微波修復(fù)10分鐘。你可以試試，時間可以根據(jù)需要自己調(diào)整。對于檸檬酸修復(fù)來說，只要高壓修復(fù)時間控制在加閥冒氣后90秒，冷水下終止開高壓鍋蓋，高壓修復(fù)和微波修復(fù)一樣不掉片子，而且一般高壓修復(fù)效果往往更好一點；關(guān)于EDTA熱修復(fù)，一般說明書上都講的是PH值等于9，實際上我試過，如果單傳用EDTA，很容易掉片子，但是用Tris-EDTA,一般就不會掉片子了，Tris-base的濃度為0.05mmol/L,高壓和微波修復(fù)都可以，PH也等于9。
5、DAB顯色后發(fā)現(xiàn)切片著色不均勻：如一片著色，一片不著色或染色淺？
著色不均勻可能與你的實驗手法有很大關(guān)系，可能原因有：
（1）切出的片子厚度本身可能就不一樣，切出一片厚，一片薄，這樣可能造成著色深淺不一。
（2）有可能是你的顯色液底物加到片子上后沒有搖勻，造成局部底物濃度不一致，所以加完顯色液后最好將片子來回左右晃動幾下，使片子上所有區(qū)域的底物濃度一致。
（3）如果你的片子是中間的染色深，靠近邊上的淺，那有可能是你蠟圈畫的太小，顯色液覆蓋的面積不過大而產(chǎn)生了邊緣效應(yīng)。最外側(cè)的組織片最好離顯色液外緣0.5cm。
