在生物藥肽圖分析、蛋白質(zhì)修飾分析、蛋白質(zhì)組學(xué)研究等諸多工作中，蛋白質(zhì)的變性與酶解是樣品處理的必經(jīng)之路。RapiGestTM SF正是在這個實驗步驟中，用以輔助蛋白酶解的變性試劑[1,2,3]。RapiGest SF有以下優(yōu)點：

■ 綜合水相、有機相溶液條件下，最高效的輔助酶解變性劑。

■ 作用過程中，不對蛋白造成副反應(yīng)化學(xué)修飾。

■ 操作簡單、全面適應(yīng)液質(zhì)分析方法。

■ 常規(guī)操作濃度對胰蛋白酶活性無抑制。

■ 可大大縮短酶解反應(yīng)時間。

■ 對各種蛋白酶、肽-N糖苷酶等多種酶解過程都適用。
 

在蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的大部分工作中，常常需要將蛋白質(zhì)酶解為多肽進行分析。但蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是以三維結(jié)構(gòu)的形式存在的，為了將蛋白高級結(jié)構(gòu)內(nèi)部的酶切位點暴露于蛋白酶的作用下，首先需要對蛋白進行變性，使蛋白舒展開。John R. Yates教授領(lǐng)導(dǎo)的團隊對各種變性劑中的輔助酶切效果進行了充分比較，其中RapiGest SF的表現(xiàn)最為（圖1）[4]。仔細(xì)觀察圖1還可以發(fā)現(xiàn)，在實驗結(jié)果中，較為常用的尿素輔助酶切效率較差。這是由于尿素對胰蛋白酶活性的抑制作用較大。實驗人員有時會采取使用尿素進行蛋白后，將反映溶液稀釋10倍，再加入胰蛋白酶的方法，以降低尿素濃度到1M以下，減少其對胰蛋白酶的抑制。但是，面對微量的生物蛋白樣本，稀釋后的體系，會大幅度降低樣品濃度，限制了后續(xù)的分析工作。此外，尿素在對蛋白變性的過程中，還會對蛋白進行一定的化學(xué)修飾，如氨基甲�；�。副反應(yīng)的發(fā)生對于多肽鑒定、組學(xué)水平蛋白定量會造成一定的影響與誤差。而使用RapiGest SF無副反應(yīng)的問題，正常使用濃度下(0.1%)對胰蛋白酶活

性也無影響（表1）。

圖1. Tris水相緩沖體系下各種變性劑的輔助酶切效果比較。樣品為mammalian cell lysate cytoplasmic fraction蛋白。

不同變性劑對胰蛋白酶活性影響對比

檢測基于胰蛋白酶誘導(dǎo)N-α-苯甲酰-L-精氨酸乙基乙酯（BAEE）水解。將0.5微克胰蛋白酶加入1mL 50mM的碳酸氫銨溶液中（pH 7.9，0.2 mM BAEE）。檢測△BAEE在253 nm下的吸收值（5分鐘內(nèi)的斜率）。

RapiGest SF雖然是一種表面活性劑，但其全面適應(yīng)液質(zhì)分析的要求。在使用RapiGest SF作為變性劑完成蛋白酶切后，如果只進行色譜分析，則可無需對RapiGest SF進行處理。如進行液質(zhì)聯(lián)用分析，則通過簡單的加酸步驟就可將RapiGest SF去除。而酸性溶液環(huán)境又恰恰是液質(zhì)分析所需的樣品溶液環(huán)境。事實上，RapiGest SF是酸性不穩(wěn)定表面活性劑，在酸性條件下（pH2）極易水解。RapiGestSF的結(jié)構(gòu)及其水解產(chǎn)物見圖2。酸化后RapiGest SF降解為兩個產(chǎn)物：2-十二酮和3-羥（2,3-二羥基丙基）丙磺酸鈉。前者與水不能互溶，通過離心去除。后者在水溶液中溶解度很高，在反相LC模式下不保留。因此，酶消解后的水溶液可直接進行LC-MS或MALDI-MS分析。

 

圖3為Ra piGest SF輔助的人單抗酶解的實例。通過BiopharmaLynxTM軟件分析，其序列覆蓋度為98%。而且LC/MS

分析中沒有發(fā)現(xiàn)錯誤酶切的多肽或完整未被酶切的蛋白。2%序列未發(fā)現(xiàn)的原因是由于此部分序列為2個氨基酸的超短肽或單個氨基酸（R或K），其無法在反相柱上保留。

圖 3.LC-MS分析RapiGest SF輔助下的人單抗胰蛋白酶酶解多肽。
 

由于其表面活性劑的屬性，RapiGest SF可以非常快速地對蛋白完成變性，從而縮短酶解實驗時間。圖4顯示，RapiGest SF輔助下，完全酶解馬肌紅蛋白只需要5分鐘。而由于肌紅蛋白屬球蛋白，其在不充分變性的情況下將難以酶解。在對照反應(yīng)中，單純與胰蛋白酶孵育條件下，即使到9小時后，仍只有少量的蛋白被酶解；而使用了RapiGest SF試劑的體系，酶解效率顯著提升。

圖 4.有無RapiGest SF輔助下，馬肌紅酶解效果對比。
 

RapiGest SF自2002年推出以來，已經(jīng)過10年的使用，它良好的性能被廣泛認(rèn)可，對各種蛋白酶、肽-N糖苷酶

等多種酶解過程都適用[5]。RapiGest SF已經(jīng)成為大部分生物質(zhì)譜科學(xué)家的常規(guī)必備試劑。