研究RNA的方法有很多種，常用的如核酸保護(hù)性分析(NPA)、RT-PCR、Northern blots等等。而Northern blots曾經(jīng)是應(yīng)用得最廣的技術(shù)之一，盡管其分辨率和操作簡(jiǎn)易性都不如前者，但Northern blots依然是檢測(cè)、定量mRNA大小及在組織中表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)方法，既是能直接提供有關(guān)RNA完整性、不同的剪接信息及mRNA大小等信息的唯一方法，也是在同一張膜上直接比較同一信息在不同樣品中的表達(dá)豐度的首選方法。Northern blots的操作步驟相當(dāng)繁瑣，且對(duì)RNase污染非常敏感，任一步操作不當(dāng)都會(huì)嚴(yán)重影響分辨率。盡管Northern blots曾經(jīng)是應(yīng)用得最廣的技術(shù)之一，但不同的實(shí)驗(yàn)室甚至不同的人往往都會(huì)根據(jù)自己的條件采用不同的方法。通常我們稱《分子克隆》所書的方法為標(biāo)準(zhǔn)方法（Maniatis）。然而優(yōu)化這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法中的以下幾個(gè)操作步驟可以使其靈敏度提高10-20倍：探針的選擇、膜的選擇和轉(zhuǎn)移方法、雜交液的選擇、甲醛還是乙二醛的選擇、試劑的質(zhì)量。以下從這些方面分別加以討論。
探針的選擇
Northern blots探針的來(lái)源有多樣性，可以是cDNA、PCR產(chǎn)物、寡核苷酸，也可以是RNA探針。由于雙鏈探針中的反義鏈與RNA結(jié)合后，存在另一鏈的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，而RNA探針則不存在這個(gè)問(wèn)題；另外RNA: RNA結(jié)合物熱穩(wěn)定性很高，RNA探針雜交要求更高的雜交溫度(68度)和更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)南茨l件，使背景降低；且合成RNA探針的DNA模版可以經(jīng)DNase消化處理，不會(huì)干擾雜交，這些因素使得選用RNA探針比DNA探針的靈敏度提高10倍以上。同樣理由，單鏈DNA探針又比Random Primed的雙鏈探針要好。
膜的選擇
由于硝酸纖維素膜通常不能耐受2輪以上的雜交和洗膜操作，而帶正電的尼龍膜對(duì)RNA的結(jié)合力強(qiáng)且能從容耐受多輪雜交而信號(hào)并不減弱，處理大張膜時(shí)又不必?fù)?dān)心撕裂或卷曲，因而成為首選。帶正電的尼龍膜的唯一缺點(diǎn)是背景較高，特別是使用RNA探針時(shí)。
樣品的選擇
由于膜的載量有限，Northern blots的上樣量因而受限，提高分辨率的方法之一是用mRNA代替總RNA電泳以提高mRNA的總量，而選用帶更高電荷的尼龍膜得到更大的結(jié)合容量也有類似的作用。
轉(zhuǎn)移方法
轉(zhuǎn)移的方法有多種，真空轉(zhuǎn)移因?yàn)榭焖俑咝Ф蔀槭走x。沒(méi)有條件做真空轉(zhuǎn)移的可以選擇毛細(xì)管轉(zhuǎn)移或電轉(zhuǎn)移。傳統(tǒng)方法為上行毛細(xì)管轉(zhuǎn)移，即吸水紙?jiān)谀z、膜的上方，需4-18小時(shí)。Ambion公司推出的NorthernMax Kir提供了一種下行毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法，即吸水紙?jiān)谀z、膜的下方，配合它的轉(zhuǎn)移緩沖液可加快RNA，特別是大分子RNA的轉(zhuǎn)移，使RNA轉(zhuǎn)移得更完全，分辨率提高，且轉(zhuǎn)移過(guò)程可縮短至１小時(shí)。
由于將核酸通過(guò)電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上要求很高的離子濃度，導(dǎo)致電流太大，需要大體積的緩沖液以保證緩沖容量不因電解而耗盡和大體積的冷卻系統(tǒng)，因而這一方法較少使用。而核酸能在低離子強(qiáng)度下電轉(zhuǎn)移固定在尼龍膜上，這也是尼龍膜優(yōu)于硝酸纖維素膜的另一原因。
雜交液的選擇
雜交液的選擇直接影響信噪比、非特異性背景的高低。雜交液中應(yīng)含有與探針匹配的阻斷劑。許多雜交液只含有DNA阻斷劑，當(dāng)要做RNA探針雜交時(shí)必須加入變性的酵母總RNA或其它RNA阻斷劑。另外雜交液應(yīng)經(jīng)過(guò)嚴(yán)格過(guò)濾以除去可能引致斑點(diǎn)背景的不溶物和小顆粒。當(dāng)然它必須是無(wú)DNAse及RNAse的。
甲醛vs.乙二醛？
在含有甲醛的變性膠中進(jìn)行RNA電泳是較常見(jiàn)的方法。相比之下，乙二醛／DMSO方法無(wú)須制備甲醛變性瓊脂糖凝膠，無(wú)須通風(fēng)櫥等安全設(shè)備，只需將樣品用乙二醛／DMSO預(yù)處理變性，在普通膠上電泳即可。但由于泳動(dòng)速度慢而往往需要將電泳液循環(huán)以避免形成過(guò)高的氫離子梯度。
