一、 材料
　　基因組DNA(大于50kb,分別來(lái)自不同的材料)。
　　二、設(shè)備
　　電泳儀及電泳槽， 照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板(比膠塊略大) 4塊，吸水紙若干，尼龍膜(依膠大小而定)，濾紙 ，eppendorf管(0.5ml)若干。
　　三、試劑：
　　1、限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切緩沖液。
　　2、5×TBE電泳緩沖液：配方見(jiàn)第一章。
　　3、變性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl 。
　　4、中和液：1mol/LTris·Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl 。
　　5、10×SSC：配方見(jiàn)第九章。
　　6、其它試劑：0.4mol/L NaOH，0.2mol/L Tris·Cl, pH7.5/2×SSC ，ddH2O，Agarose 0.8%， 0.25mol/L HCl 。
　　四. 操作步驟
　　1. 基因組DNA的酶解
　　(1) 大片斷DNA的提取詳見(jiàn)基因組DNA提取實(shí)驗(yàn),要求提取的DNA分子量大于50kb, 沒(méi)有降解。
　　(2) 在50μl反應(yīng)體系中,進(jìn)行酶切反應(yīng):
　　　　5μg基因組DNA
　　　　5μl 10×酶切緩沖液
　　　　20單位（U）限制酶(任意一種)
　　　　加ddH2 O, 至50μl
　　(3) 輕微振蕩, 離心,37℃反應(yīng)過(guò)夜。
　　(4) 取5μl反應(yīng)液,0.8％瓊脂糖電泳觀察酶切是否徹底，這時(shí)不應(yīng)有大于30kb的明顯亮帶出現(xiàn)。
　　[注意] 未酶切的DNA要防止發(fā)生降解, 酶切反應(yīng)一定要徹底。
　　2. Southern轉(zhuǎn)移
　�。�1） 酶解的DNA經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳(可18V過(guò)夜)后EB染色觀察。 　　
　�。�2） 將凝膠塊浸沒(méi)于0.25mol/L HCl中脫嘌呤, 10分鐘。 　　
　　（3） 取出膠塊, 蒸餾水漂洗, 轉(zhuǎn)至變性液變性45分鐘。經(jīng)蒸餾水漂洗后轉(zhuǎn)至中和液中和30分鐘。
　�。�4） 預(yù)先將尼龍膜,濾紙浸入水中,再浸入10×SSC中,將一玻璃板架于盆中鋪一層濾紙(橋)然后將膠塊反轉(zhuǎn)放置,蓋上尼龍膜,上覆二層濾紙,再加蓋吸水紙,壓上半公斤重物, 以10×SSC鹽溶液吸印,維持18-24小時(shí)。也可用電轉(zhuǎn)移或真空轉(zhuǎn)移。
　�。�5） 取下尼龍膜, 0.4mol/L NaOH 30秒, 迅速轉(zhuǎn)至0.2mol/L Tris·Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中, 5分鐘。
　�。�6） 將膜夾于2層濾紙內(nèi), 80℃真空干燥2小時(shí)。
　�。�7） 探針的制備和雜交見(jiàn)第九章分子雜交部分。
　　[注意] 1、 步驟（2）中脫嘌呤時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)。
　　　　　　2、 除步驟（1）、（4）、（5）外, 其余均在搖床上進(jìn)行操作。
　　　　　　3、步驟（4）中,當(dāng)尼龍膜覆于膠上時(shí), 絕對(duì)防止膠與膜之間有氣泡發(fā)生, 加蓋濾時(shí)也不應(yīng)有氣泡發(fā)生。
　　　　　　4、有時(shí)用一種限制性內(nèi)切酶不能發(fā)現(xiàn)RFLP的差異，這時(shí)應(yīng)該試用另一種酶。