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HPLC中的干擾峰是廣大色譜工作者甚為頭疼的事情，我們通過對干擾峰的來源進(jìn)行分類，對其產(chǎn)生原因進(jìn)行分析探究，以便大家進(jìn)行參考快速解決同類問題。
關(guān)于其干擾峰，我們簡單分為三類：試劑或溶劑、器材以及液相系統(tǒng)。下面我們會對每一類干擾峰來源做簡單的分析。
試劑或溶劑
HPLC中，常用的試劑主要是有機(jī)溶劑、各種鹽類及水。有機(jī)溶劑一般多為購買的色譜級，所以出現(xiàn)問題的幾率較小。但是分裝出的有機(jī)溶劑，由于多次使用，被污染的概率較大，因此引入干擾峰的幾率較高。其次是水，水中的雜質(zhì)是干擾峰的主要來源之一，這是大家極易忽視的問題。
采集波長較低的檢測方法，建議使用高品質(zhì)水，這樣可以避免很多因?yàn)樗|(zhì)帶來的問題。再次是各種鹽類，這也是色譜干擾峰的主要來源之一。對于無機(jī)鹽引入的干擾峰，在方法開發(fā)初期一般就會給眼關(guān)注，尋找解決方案。方法確定后，鹽的品種及級別也同時確定，因此鹽對方法的影響基本可控。
水和無機(jī)鹽引起的干擾峰，比較快捷的解決方案是安裝鬼峰補(bǔ)集柱，這樣可以有效的避免此類干擾。如果使用離子對試劑，則需選擇不影響離子對試劑的鬼峰補(bǔ)集柱。
研創(chuàng)鬼峰柱
器材
干擾峰來源的第二個方面是流動相配制及樣品前處理過程中接觸的各種器材。
首先是流動相配制過程中接觸的器材，包括燒杯、玻璃棒、pH計(jì)、濾杯、濾膜、流動相瓶等。燒杯、玻璃棒是配制流動相首先接觸的器材，因此建議配制流動相的燒杯、玻璃棒專用。濾杯實(shí)驗(yàn)人員只要清洗干凈一般不會帶來污染。需要注意的是，如果過濾含有離子對的流動相，建議增加清洗次數(shù)，避免清洗不干凈污染后續(xù)流動相。因此，對濾杯的清洗應(yīng)該建立基本的洗滌規(guī)程，保證實(shí)驗(yàn)人員對使用的器材清洗到位。濾膜也是干擾峰引入源頭之一。如圖3所示，乙腈經(jīng)過有機(jī)系濾膜過濾后，在梯度洗脫中會引入較大干擾峰。鑒于色譜級試劑廠家已經(jīng)過膜，且多數(shù)儀器都有脫氣機(jī)，所以我們建議無需再對甲醇、乙腈等純有機(jī)相過濾。流動相瓶引入干擾峰的現(xiàn)象主要出現(xiàn)在夏季，這是由于夏季溫度高，純水相容易滋生細(xì)菌。后續(xù)的流動相瓶使用人員清洗不到位，所以導(dǎo)致引入干擾峰。因此流動相瓶的清洗要建立嚴(yán)格的洗滌規(guī)程。
再次樣品前處理過程中接觸的器材。前處理過程中接觸的器材主要包括容量瓶、濾頭、注射器及進(jìn)樣瓶。容量瓶的清洗同流動相瓶、過濾裝置一樣，要建立良好的清洗規(guī)程。移液器材以及濾頭、注射器，多為塑料制品，其化學(xué)惰性較玻璃制品差，因此容易引入干擾峰。如下圖4、圖5、圖6所示案例，此方法檢測波長為210納米，溶劑為正己烷-異丙醇（90:10），溶劑分別接觸移液槍槍頭、一次性吸管、一次性注射器后，均引入不同的干擾峰。
進(jìn)樣小瓶若為一次性使用，一般不會引入干擾峰。如果進(jìn)樣瓶反復(fù)清洗，多次使用，則應(yīng)建立清洗規(guī)程并對其清洗干凈程度進(jìn)行確認(rèn)。
液相系統(tǒng)
與前兩類干擾峰相比，液相系統(tǒng)干擾峰的解決更加困難。液相系統(tǒng)是一個動態(tài)過程，所以此類問題解決過程耗費(fèi)時間長，而且要求實(shí)驗(yàn)人員有很高的色譜素養(yǎng)。我們對此類問題來源主要?dú)w結(jié)為三類：強(qiáng)保留物質(zhì)、離子對污染和管路滋生細(xì)菌。
首先是強(qiáng)保留物質(zhì)的干擾，其主要特征是寬峰。此類問題多數(shù)發(fā)生在等度洗脫中，梯度洗脫主要出現(xiàn)在高比例有機(jī)相處。這是由于強(qiáng)保留物質(zhì)在當(dāng)次進(jìn)樣中未洗脫出，在后續(xù)進(jìn)樣洗脫出來所致。
對于此類干擾峰，可通過延長采集時間或增加洗脫強(qiáng)度來消除對后續(xù)樣品的干擾。至于如何延長采集時間，大家可通過下面的公式計(jì)算得到。
N＝5.54*(tR/Wb/2)^2（1）
由公式（1）推導(dǎo)可知
tR＝Wb/2 *(N/5.54)^(1/2)（2）
其中，N-塔板數(shù)，在等度洗脫中N對所有峰相同；tR-保留時間；Wb/2-色譜峰半峰寬。
由公式（2）推知，tR2=tR1* W2b/2/W1b/2。積分結(jié)果顯示，圖7中，7min處的色譜峰W1b/2=0.12min，9min處的寬峰W1b/2=0.32min，由此可推知，圖7中9min處的寬峰保留時間tR2=7*0.32/0.12=18.6min。圖8為延長采集時間的圖譜，20min處即為圖7中9min處的色譜峰，與公式推導(dǎo)結(jié)果基本接近。延長采集時間后，后續(xù)圖譜干擾峰消失。盡管按照此公式計(jì)算會有一定誤差，但這足以讓色譜工作者對其進(jìn)行預(yù)判，設(shè)置合理的采集時間。
系統(tǒng)干擾峰第二個方面是離子對、螯合劑這種難以洗脫的試劑對液相系統(tǒng)的污染。此類污染物多半是由于使用完畢含有離子對、螯合劑之類的流動相后，對系統(tǒng)的沖洗不徹底所致。此類污染物主要對一些采集波長較低的方法產(chǎn)生干擾，普遍表現(xiàn)是基線噪音大或者干擾峰，但隨著方法的運(yùn)行會逐漸趨于正常。
系統(tǒng)干擾峰第三個方面是系統(tǒng)滋生細(xì)菌。對于系統(tǒng)滋生細(xì)菌，多數(shù)大家可能覺得不可思議，因?yàn)橐合嘞到y(tǒng)使用完畢都會用有機(jī)相沖洗保存。目前很多方法流動相A都是水相，雖然水相每日都會新配制，但如果由濾頭到比例閥這一段管路長時間在水相中就會滋生細(xì)菌。隨著時間的運(yùn)行，梯度洗脫中會逐漸的產(chǎn)生干擾峰。此類問題雖然比較隱蔽，但比較容易解決，只要每日對放置純水相的通道用有機(jī)相沖洗即可避免此類問題。
以上便是對干擾峰來源的簡單分析。然而對于干擾峰的產(chǎn)生，要具體問題具體分析，因?yàn)槠溥�與具體色譜條件有關(guān)。同一種試劑，在方法A中產(chǎn)生干擾，但在方法B中可能完全沒有干擾。因?yàn)椴杉ㄩL，有機(jī)相初始比例及最終比例等因素，都可能會對干擾峰的出現(xiàn)產(chǎn)生影響。
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實(shí)際工作中，色譜工作者遇到的最大困難是如何識別判斷干擾峰屬于哪一類。由于找不清問題根源，所以也就難以有針對性的解決問題。下面為大家簡單分享一下解決干擾峰的小經(jīng)驗(yàn)：
首先，判斷干擾峰是來自系統(tǒng)還是供試品。此時需要運(yùn)行兩次采集：只運(yùn)行梯度與正常進(jìn)樣。如果只運(yùn)行梯度，未進(jìn)樣品，依然有干擾峰，這種情況下多半是系統(tǒng)所致，此時解決方向應(yīng)針對液相體系，而不是針對供試品。鑒于有些型號的儀器，如果不進(jìn)樣，不會執(zhí)行進(jìn)樣的動作。因此，對于此類儀器，建議執(zhí)行正常進(jìn)樣與減少進(jìn)樣量兩次采集，根據(jù)干擾峰的大小來判斷是系統(tǒng)原因還是供試品原因。
其次，調(diào)查儀器使用記錄，與實(shí)驗(yàn)人員交流。一般建議查看儀器使用記錄，了解近期運(yùn)行哪些方法以及這些方法的流動相組成。查看完相關(guān)記錄后，再跟實(shí)驗(yàn)人員交流，了解其操作過程。比如，對于A通道滋生細(xì)菌問題，我們可以通過儀器使用記錄發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)干擾峰的儀器近一周都是在運(yùn)行同一個方法。實(shí)驗(yàn)記錄顯示，此方法的流動相為0.1%的磷酸水溶液，因此可能是系統(tǒng)滋生細(xì)菌所致。但實(shí)驗(yàn)人員告知，每天晚上都會用有機(jī)相沖洗色譜柱，不可能滋生細(xì)菌。再次詢問得知，實(shí)驗(yàn)人員每晚的沖洗是切換成C通道執(zhí)行，而A通道卻一直在0.1%的磷酸水溶液中。因此，切換通道沖洗系統(tǒng)這種不規(guī)范操應(yīng)盡量避免。
第三，采取單因素試驗(yàn)解決問題。每次只改變一個因素，逐步找到干擾峰的來源。此類做法看似比較費(fèi)時費(fèi)力，但卻讓色譜工作者對各類色譜問題產(chǎn)生原因有理性認(rèn)知，增強(qiáng)了色譜工作者解決問題能力，有助于后期問題的解決排查。
