異常峰分析

異常的色譜峰指的是色譜圖中的無峰或出現(xiàn)負(fù)峰、寬峰、雙峰、肩峰、峰形不對(duì)稱等情況。異常峰是色譜實(shí)驗(yàn)工作中最棘手的問題。這些峰嚴(yán)重影響色譜分析的結(jié)果。色譜圖中不可能有純正的高斯對(duì)稱峰 , 輕微的拖尾是正常的 , 這是由分離系統(tǒng)所決定的。在此僅對(duì)幾種異常峰進(jìn)行分析。

1.峰前或峰后有小峰的分析

產(chǎn)生原因大致分為以下幾種情形

(1) 樣品不純�？筛淖儾煌�的流動(dòng)相和色譜柱 ,對(duì)樣品進(jìn)行分離比較 , 選擇合適的分離條件。

(2) 分析柱或保護(hù)柱柱頭塌陷。此情況較常見 ,可更換分析柱或保護(hù)柱后對(duì)峰形進(jìn)行比較。柱頭塌陷時(shí)往往所有的峰都會(huì)出現(xiàn)峰分裂 。對(duì)色譜柱再生和清洗可以改善分離效果。

(3) 色譜柱柱容量下降。當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間使用后 , 有一些強(qiáng)保留組分吸附在柱子中 , 不大的進(jìn)樣量往往就會(huì)出現(xiàn)峰分裂。用強(qiáng)洗脫能力的溶劑清洗色譜柱 , 或更換色譜柱可使問題得到改善。

(4) 樣品溶劑與流動(dòng)相不匹配或進(jìn)樣體積過大。當(dāng)樣品溶劑比流動(dòng)相極性大時(shí) , 有時(shí)即使進(jìn)樣體積很小 , 也容易出現(xiàn)峰變形和裂分現(xiàn)象。建議用流動(dòng)相溶解樣品。

(5) 流動(dòng)相不恰當(dāng)。此情況較罕見 , 有些樣品在特定的色譜條件下可能存在結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)平衡 , 而出雙峰 , 這種雙峰是無法分離完全的 , 改變色譜條件尤其是p H 值會(huì)使峰形正常。

(6) 樣品分解。不穩(wěn)定的樣品在色譜分離過程中變成其他物質(zhì)而出現(xiàn)雙峰。這時(shí)需改變樣品處理方法或色譜分離條件。

2.負(fù)峰分析

在色譜分析中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)負(fù)峰或倒峰 , 如圖 3 中的大峰的左下就有一負(fù)峰。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由以下幾種原因引起的 , 可針對(duì)不同情況進(jìn)行排除 , 進(jìn)而使問題得到解決。

(1) 流動(dòng)相吸收本底值過高。此時(shí)可適當(dāng)改變檢測(cè)波長(zhǎng)。

(2) 進(jìn)樣過程中進(jìn)入空氣。進(jìn)行排氣處理 , 直到基線平穩(wěn)再進(jìn)樣。

(3) 樣品組分的吸收低于流動(dòng)相�？筛淖兞鲃�(dòng)相或改變檢測(cè)波長(zhǎng)。

(4) 配制樣品的溶液與流動(dòng)相不一樣。重新配制樣品 , 用與流動(dòng)相一樣的溶劑配制或稀釋樣品。

3.前沿、拖尾峰分析

拖尾：1 干擾峰，優(yōu)化條件分離 ；2 色譜柱塌陷，更換色譜柱； 3 流動(dòng)相pH不合適，調(diào)節(jié)pH值 ；4 管路沒有接好，存在較大的死體積，可以重新接一下。

前沿：1 溶劑選擇不合適，選擇合適的溶劑 ；2 樣品過載，降低進(jìn)樣量； 3 柱溫太低，升高柱溫 ；4 色譜柱損壞，更換色譜柱 ；

圖譜前沿和拖尾的原因主要是流動(dòng)相選擇不合適，可以相應(yīng)調(diào)整流動(dòng)相的極性，或者適當(dāng)加入酸來調(diào)整，可以得到較好的改善。一般來講，酸堿在流動(dòng)相中對(duì)于前沿和拖尾影響較大。  柱前沿是可能因?yàn)橹�超載，拖尾是可能因?yàn)闃悠繁晃廴荆�選擇合適的流動(dòng)相，調(diào)節(jié)好PH能夠改善這以情況。

前輩們總是會(huì)告訴我們，拖尾峰與柱子有關(guān)，可能是過載，稀釋樣品再做，或換新柱做。 有時(shí)候托尾峰往往是有機(jī)性相近雜質(zhì)沒有分開，此時(shí)，可以優(yōu)化分析方法，或更換柱子試一試；也可能由于柱子使用時(shí)間太久柱效下降出現(xiàn)塌陷等原因；再有也會(huì)根樣品本身性質(zhì)有關(guān)，基團(tuán)需要流動(dòng)相中添加能與之結(jié)合優(yōu)化峰形的化學(xué)物質(zhì)，要根據(jù)具體情況而定。

4.色譜雙峰產(chǎn)生的可能及判斷和處理

液相上有一句經(jīng)典的話說得好 “出兩個(gè)峰肯定不是一種物質(zhì)，出一個(gè)峰不一定是一種物質(zhì)”。

而色譜雙峰指的是明是一種物質(zhì)，但在色譜圖中出現(xiàn)雙峰，而表明含二種物質(zhì)。我將這種情況分為四種原因。  

1）色譜柱  

如果你分析樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)每個(gè)色譜峰都雙峰出現(xiàn)（出峰越快，雙峰的可能性會(huì)減少），尤其采用單一純物質(zhì)時(shí)，可以肯定色譜柱出問題－柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失。如果進(jìn)樣量少，原來色譜柱正常，色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰，不一定拖尾，這一般應(yīng)是柱頭受堵，將色譜柱反過來接，用流動(dòng)相沖洗或酸洗或其它溶劑，將堵在柱頭的殘留物沖掉，再反過來，一般情況下就行了。當(dāng)然不反沖，正沖有時(shí)也會(huì)正常的。如果峰拖尾，雙峰強(qiáng)弱相差不大，柱頭固定相變臟或流失可能性更大，高頻紅外碳硫分析儀這是可以將進(jìn)樣那頭擰開，將微孔濾片超聲，柱頭刮去一部分填料，重新填上新填料擰緊，不過這種活，需要一定技術(shù)，同時(shí)不能老干那種事，否則用不了幾次，色譜柱就會(huì)應(yīng)柱效很低而報(bào)廢。  

2）溶劑極性及進(jìn)樣量  

許多HPLC分析者對(duì)此可能不以為然，一般的HPLC的書籍和文獻(xiàn)都不會(huì)提到這方面的內(nèi)容，而這確是雙峰產(chǎn)生的一個(gè)很重要的原因。目前HPLC分析多為反相色譜，流動(dòng)相多為甲醇、乙腈、水，加各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與流動(dòng)相相溶的溶劑溶解。最佳的溶解方法是用流動(dòng)相溶解，但是很多情況是不一致的。當(dāng)用溶劑極性強(qiáng)度大的試劑，如純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體系中以水為主，樣品進(jìn)樣量大，如定量管為20ul，此條件下完全可以肯定，單一的純物質(zhì)出雙峰，第二峰比第一峰�。�每次都不太一樣），且拖尾，保留時(shí)間會(huì)提前（相對(duì)進(jìn)樣量少而言），將進(jìn)樣量減少一半以上，峰型將變?yōu)檎�常。這是樣品的溶劑與流動(dòng)相極性相差太大，而流動(dòng)相來不及將其稀釋達(dá)到平衡造成的。上面提到進(jìn)樣量造成雙峰的一個(gè)原因，另一個(gè)原因是，進(jìn)樣量不一定大，但絕對(duì)量很大，色譜圖上的雙峰緊靠在一起，基本上齊高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色譜柱問題）。將樣品稀釋再進(jìn)樣就可以了，這是由于進(jìn)樣量過大，色譜柱過載造成的。  

3）樣品的特性  

有些樣品由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，存在互變異構(gòu)現(xiàn)象，而這種互變異構(gòu)體無法分開，而是以一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡存在。在色譜分析時(shí)，在一個(gè)特定的條件下，一種物質(zhì)將出現(xiàn)雙峰，雙峰靠的很近，基本齊高，不拖尾，條件稍一變化，尤其pH，雙峰現(xiàn)象將消失，如紅霉素等。有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰，但在LC－MS下，用質(zhì)譜檢測(cè)器，其質(zhì)譜的總離子流圖上較明顯，例如我分析過的農(nóng)藥啶蟲瞇（吡蟲清）。  

4）參數(shù)

記錄的參數(shù)一般都內(nèi)定的，不必修改，但GC和HPLC的參數(shù)是不完全一致的，例如C－R3A數(shù)據(jù)記錄儀上的一般記錄時(shí)間間隔GC為2ms，HPLC 為5ms，如果記錄間隔時(shí)間縮短，一個(gè)峰將變?yōu)槎�個(gè)峰或更多。

5.鬼峰、倒峰、未出峰

6.峰裂分

裂峰產(chǎn)生原因的確定

• 樣品基質(zhì)復(fù)雜或分析多種樣品——柱污染或部分阻塞濾片

• 流動(dòng)相 pH>=7——由于硅膠溶解導(dǎo)致柱塌陷(除非使用專門的柱子)

• 溶劑比流動(dòng)相的強(qiáng)度大——可能產(chǎn)生裂峰或?qū)挿�，由樣品量決定 （溶劑化效應(yīng)）

7.峰拖尾、峰展寬、峰前伸

峰拖尾原因的確定

• 評(píng)價(jià)柱選擇——使用高純度硅膠柱或不同鍵合技術(shù)柱

• 評(píng)價(jià)流動(dòng)相效果——改變流動(dòng)相pH和添加劑消除次級(jí)效應(yīng)(流動(dòng)相中組份與柱子相互作用)

• 減小進(jìn)樣量

• 消除柱外效應(yīng)

• 沖洗柱子——檢查柱子老化/塌陷

易記小卡片來了：其它常見峰異常問題匯總

Q&A峰問答

進(jìn)行HPLC分析時(shí)，怎樣才能知道某一個(gè)色譜峰是否是單一峰呢？特別是分析中藥成分的時(shí)候？標(biāo)準(zhǔn)品加入法、DAD、還有改變流動(dòng)相的組成是否能說明呢？

1、多種不同原理的方法比較是首選。

2、其次采用DAD檢測(cè)器進(jìn)行光譜分析，如果提示不純，估計(jì)有問題。純度閾值受儀器、流動(dòng)相等影響，所以只能作為參考。對(duì)于分子結(jié)構(gòu)中差異有紫外吸收官能團(tuán)的，dad檢測(cè)器一般還是可以準(zhǔn)確判斷峰純度的，但對(duì)于結(jié)構(gòu)中無紫外吸收的那些差異，DAD檢測(cè)器就無能為力了，比如某肽鏈中的氨基酸差異、或者一些對(duì)應(yīng)異構(gòu)體，dad也是無能為力的。

3、如果DAD不行，那么就需要采用質(zhì)譜鑒別了，優(yōu)選液質(zhì)聯(lián)用，如果是含鹽流動(dòng)相，可以采用收集不同時(shí)段的色譜流出物的方式，脫鹽，進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

4、如果懷疑有異構(gòu)體，這個(gè)就比較頭疼了，非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體需要二級(jí)（主要是對(duì)CID的能量有要求，可以打斷側(cè)鏈）的質(zhì)譜才能判斷側(cè)鏈的區(qū)別。對(duì)應(yīng)異構(gòu)體的辨別目前好像只有waters的離子淌度質(zhì)譜（沒做過）有一定的分辨能力，但也不是萬(wàn)能的。