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一、試劑/溶劑
其次是水，水中的雜質(zhì)是干擾峰的主要來(lái)源之一，這是大家極易忽視的問題。采集波長(zhǎng)較低的檢測(cè)方法，建議使用高品質(zhì)水，這樣可以避免很多因?yàn)樗|(zhì)帶來(lái)的問題。再次是各種鹽類，這也是色譜干擾峰的主要來(lái)源之一。如圖2所示，與圖1相比，如圖2加入磷酸二氫鉀后，16.5min處出現(xiàn)干擾峰。對(duì)于無(wú)機(jī)鹽引入的干擾峰，在方法開發(fā)初期一般就會(huì)特別關(guān)注，尋找解決方案。方法確定后，鹽的品種及級(jí)別也同時(shí)確定，因此鹽對(duì)方法的影響基本可控。 水和無(wú)機(jī)鹽引起的干擾峰，比較快捷的解決方案是安裝鬼峰補(bǔ)集柱，這樣可以有效的避免此類干擾。如果使用離子對(duì)試劑，則需選擇不影響離子對(duì)試劑的鬼峰補(bǔ)集柱。
再次樣品前處理過程中接觸的器材。前處理過程中接觸的器材主要包括容量瓶、濾頭、注射器及進(jìn)樣瓶。容量瓶的清洗同流動(dòng)相瓶、過濾裝置一樣，要建立良好的清洗規(guī)程。移液器材以及濾頭、注射器，多為塑料制品，其化學(xué)惰性較玻璃制品差，因此容易引入干擾峰。如下圖4、圖5、圖6所示案例，此方法檢測(cè)波長(zhǎng)為210納米，溶劑為正己烷-異丙醇（90:10），溶劑分別接觸移液槍槍頭、一次性吸管、一次性注射器后，均引入不同的干擾峰。
進(jìn)樣小瓶若為一次性使用，一般不會(huì)引入干擾峰。如果進(jìn)樣瓶反復(fù)清洗，多次使用，則應(yīng)建立清洗規(guī)程并對(duì)其清洗干凈程度進(jìn)行確認(rèn)。
與前兩類干擾峰相比，液相系統(tǒng)干擾峰的解決更加困難。液相系統(tǒng)是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，所以此類問題解決過程耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，而且要求實(shí)驗(yàn)人員有很高的色譜素養(yǎng)。對(duì)此類問題來(lái)源主要?dú)w結(jié)為三類：強(qiáng)保留物質(zhì)、離子對(duì)污染和管路滋生細(xì)菌。首先是強(qiáng)保留物質(zhì)的干擾，其主要特征是寬峰。此類問題多數(shù)發(fā)生在等度洗脫中，梯度洗脫主要出現(xiàn)在高比例有機(jī)相處。這是由于強(qiáng)保留物質(zhì)在當(dāng)次進(jìn)樣中未洗脫出，在后續(xù)進(jìn)樣洗脫出來(lái)所致。如圖7中9分鐘處的色譜峰。
對(duì)于此類干擾峰，可通過延長(zhǎng)采集時(shí)間或增加洗脫強(qiáng)度來(lái)消除對(duì)后續(xù)樣品的干擾。 系統(tǒng)干擾峰第二個(gè)方面是離子對(duì)、螯合劑這種難以洗脫的試劑對(duì)液相系統(tǒng)的污染。此類污染物多半是由于使用完畢含有離子對(duì)、螯合劑之類的流動(dòng)相后，對(duì)系統(tǒng)的沖洗不徹底所致。此類污染物主要對(duì)一些采集波長(zhǎng)較低的方法產(chǎn)生干擾，普遍表現(xiàn)是基線噪音大或者干擾峰，但隨著方法的運(yùn)行會(huì)逐漸趨于正常。 系統(tǒng)干擾峰第三個(gè)方面是系統(tǒng)滋生細(xì)菌。對(duì)于系統(tǒng)滋生細(xì)菌，多數(shù)讀者可能覺得不可思議，因?yàn)橐合嘞到y(tǒng)使用完畢都會(huì)用有機(jī)相沖洗保存。目前很多方法流動(dòng)相A都是水相，雖然水相每日都會(huì)新配制，但如果由濾頭到比例閥這一段管路長(zhǎng)時(shí)間在水相中就會(huì)滋生細(xì)菌。隨著時(shí)間的運(yùn)行，梯度洗脫中會(huì)逐漸的產(chǎn)生干擾峰。此類問題雖然比較隱蔽，但比較容易解決，只要每日對(duì)放置純水相的通道用有機(jī)相沖洗即可避免此類問題。 實(shí)際工作中，色譜工作者遇到的最大困難是如何識(shí)別判斷干擾峰屬于哪一類。由于找不清問題根源，所以也就難以有針對(duì)性的解決問題。
異常的色譜峰指的是色譜圖中的無(wú)峰或出現(xiàn)負(fù)峰、寬峰、雙峰、肩峰、峰形不對(duì)稱等情況。異常峰是色譜實(shí)驗(yàn)工作中最棘手的問題。這些峰嚴(yán)重影響色譜分析的結(jié)果。色譜圖中不可能有純正的高斯對(duì)稱峰 , 輕微的拖尾是正常的 , 這是由分離系統(tǒng)所決定的。在此僅對(duì)幾種異常峰進(jìn)行分析。
產(chǎn)生原因大致分為以下幾種情形 (1) 樣品不純�？筛淖儾煌牧鲃�(dòng)相和色譜柱 ,對(duì)樣品進(jìn)行分離比較 , 選擇合適的分離條件。 (2) 分析柱或保護(hù)柱柱頭塌陷。此情況較常見 ,可更換分析柱或保護(hù)柱后對(duì)峰形進(jìn)行比較。柱頭塌陷時(shí)往往所有的峰都會(huì)出現(xiàn)峰分裂 。對(duì)色譜柱再生和清洗可以改善分離效果。 (3) 色譜柱柱容量下降。當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間使用后 , 有一些強(qiáng)保留組分吸附在柱子中 , 不大的進(jìn)樣量往往就會(huì)出現(xiàn)峰分裂。用強(qiáng)洗脫能力的溶劑清洗色譜柱 , 或更換色譜柱可使問題得到改善。 (4) 樣品溶劑與流動(dòng)相不匹配或進(jìn)樣體積過大。當(dāng)樣品溶劑比流動(dòng)相極性大時(shí) , 有時(shí)即使進(jìn)樣體積很小 , 也容易出現(xiàn)峰變形和裂分現(xiàn)象。建議用流動(dòng)相溶解樣品。 (5) 流動(dòng)相不恰當(dāng)。此情況較罕見 , 有些樣品在特定的色譜條件下可能存在結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)平衡 , 而出雙峰 , 這種雙峰是無(wú)法分離完全的 , 改變色譜條件尤其是p H 值會(huì)使峰形正常。 (6) 樣品分解。不穩(wěn)定的樣品在色譜分離過程中變成其他物質(zhì)而出現(xiàn)雙峰。這時(shí)需改變樣品處理方法或色譜分離條件。
在色譜分析中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)負(fù)峰或倒峰 , 大峰的左下就有一負(fù)峰。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由以下幾種原因引起的 , 可針對(duì)不同情況進(jìn)行排除 , 進(jìn)而使問題得到解決。 (1) 流動(dòng)相吸收本底值過高。此時(shí)可適當(dāng)改變檢測(cè)波長(zhǎng)。 (2) 進(jìn)樣過程中進(jìn)入空氣。進(jìn)行排氣處理 , 直到基線平穩(wěn)再進(jìn)樣。 (3) 樣品組分的吸收低于流動(dòng)相�？筛淖兞鲃�(dòng)相或改變檢測(cè)波長(zhǎng)。 (4) 配制樣品的溶液與流動(dòng)相不一樣。重新配制樣品 , 用與流動(dòng)相一樣的溶劑配制或稀釋樣品。
拖尾：1 干擾峰，優(yōu)化條件分離 ；2 色譜柱塌陷，更換色譜柱；3 流動(dòng)相pH不合適，調(diào)節(jié)pH值 ；4 管路沒有接好，存在較大的死體積，可以重新接一下。 前沿：1 溶劑選擇不合適，選擇合適的溶劑 ；2 樣品過載，降低進(jìn)樣量；3 柱溫太低，升高柱溫 ；4 色譜柱損壞，更換色譜柱 ； 圖譜前沿和拖尾的原因主要是流動(dòng)相選擇不合適，可以相應(yīng)調(diào)整流動(dòng)相的極性，或者適當(dāng)加入酸來(lái)調(diào)整，可以得到較好的改善。一般來(lái)講，酸堿在流動(dòng)相中對(duì)于前沿和拖尾影響較大。 柱前沿是可能因?yàn)橹d，拖尾是可能因?yàn)闃悠繁晃廴�，選擇合適的流動(dòng)相，調(diào)節(jié)好PH能夠改善這以情況。 前輩們總是會(huì)告訴我們，拖尾峰與柱子有關(guān)，可能是過載，稀釋樣品再做，或換新柱做。 有時(shí)候托尾峰往往是有機(jī)性相近雜質(zhì)沒有分開，此時(shí)，可以優(yōu)化分析方法，或更換柱子試一試；也可能由于柱子使用時(shí)間太久柱效下降出現(xiàn)塌陷等原因；再有也會(huì)根樣品本身性質(zhì)有關(guān)，基團(tuán)需要流動(dòng)相中添加能與之結(jié)合優(yōu)化峰形的化學(xué)物質(zhì)，要根據(jù)具體情況而定。
液相上有一句經(jīng)典的話說得好 “出兩個(gè)峰肯定不是一種物質(zhì)，出一個(gè)峰不一定是一種物質(zhì)”。 而色譜雙峰指的是明是一種物質(zhì)，但在色譜圖中出現(xiàn)雙峰，而表明含二種物質(zhì)。我將這種情況分為四種原因。 （1）色譜柱 如果你分析樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)每個(gè)色譜峰都雙峰出現(xiàn)（出峰越快，雙峰的可能性會(huì)減少），尤其采用單一純物質(zhì)時(shí)，可以肯定色譜柱出問題－柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失。如果進(jìn)樣量少，原來(lái)色譜柱正常，色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰，不一定拖尾，這一般應(yīng)是柱頭受堵，將色譜柱反過來(lái)接，用流動(dòng)相沖洗或酸洗或其它溶劑，將堵在柱頭的殘留物沖掉，再反過來(lái)，一般情況下就行了。當(dāng)然不反沖，正沖有時(shí)也會(huì)正常的。如果峰拖尾，雙峰強(qiáng)弱相差不大，柱頭固定相變臟或流失可能性更大，高頻紅外碳硫分析儀這是可以將進(jìn)樣那頭擰開，將微孔濾片超聲，柱頭刮去一部分填料，重新填上新填料擰緊，不過這種活，需要一定技術(shù)，同時(shí)不能老干那種事，否則用不了幾次，色譜柱就會(huì)應(yīng)柱效很低而報(bào)廢。 （2）溶劑極性及進(jìn)樣量 許多HPLC分析者對(duì)此可能不以為然，一般的HPLC的書籍和文獻(xiàn)都不會(huì)提到這方面的內(nèi)容，而這確是雙峰產(chǎn)生的一個(gè)很重要的原因。目前HPLC分析多為反相色譜，流動(dòng)相多為甲醇、乙腈、水，加各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與流動(dòng)相相溶的溶劑溶解。最佳的溶解方法是用流動(dòng)相溶解，但是很多情況是不一致的。 當(dāng)用溶劑極性強(qiáng)度大的試劑，如純甲醇、純乙腈，純乙醇，而分析體系中以水為主，樣品進(jìn)樣量大，如定量管為20ul，此條件下完全可以肯定，單一的純物質(zhì)出雙峰，第二峰比第一峰�。看味疾惶粯樱�，且拖尾，保留時(shí)間會(huì)提前（相對(duì)進(jìn)樣量少而言），將進(jìn)樣量減少一半以上，峰型將變?yōu)檎�。這是樣品的溶劑與流動(dòng)相極性相差太大，而流動(dòng)相來(lái)不及將其稀釋達(dá)到平衡造成的。上面提到進(jìn)樣量造成雙峰的一個(gè)原因，另一個(gè)原因是，進(jìn)樣量不一定大，但絕對(duì)量很大，色譜圖上的雙峰緊靠在一起，基本上齊高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色譜柱問題）。將樣品稀釋再進(jìn)樣就可以了，這是由于進(jìn)樣量過大，色譜柱過載造成的。 （3）樣品的特性 有些樣品由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，存在互變異構(gòu)現(xiàn)象，而這種互變異構(gòu)體無(wú)法分開，而是以一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡存在。在色譜分析時(shí)，在一個(gè)特定的條件下，一種物質(zhì)將出現(xiàn)雙峰，雙峰靠的很近，基本齊高，不拖尾，條件稍一變化，尤其pH，雙峰現(xiàn)象將消失，如紅霉素等。有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰，但在LC－MS下，用質(zhì)譜檢測(cè)器，其質(zhì)譜的總離子流圖上較明顯，例如我分析過的農(nóng)藥啶蟲瞇（吡蟲清）。 （4）參數(shù) 記錄的參數(shù)一般都內(nèi)定的，不必修改，但GC和HPLC的參數(shù)是不完全一致的，例如C－R3A數(shù)據(jù)記錄儀上的一般記錄時(shí)間間隔GC為2ms，HPLC 為5ms，如果記錄間隔時(shí)間縮短，一個(gè)峰將變?yōu)槎䝼�(gè)峰或更多。
高效液相色譜法中，常用的試劑主要是有機(jī)溶劑、各種鹽類及水。有機(jī)溶劑一般多為購(gòu)買的色譜級(jí)，所以出現(xiàn)問題的幾率較小。但是分裝出的有機(jī)溶劑，由于多次使用，被污染的概率較大，因此引入干擾峰的幾率較高。
二、器材
干擾峰來(lái)源的第二個(gè)方面是流動(dòng)相配制及樣品前處理過程中接觸的各種器材。
首先是流動(dòng)相配制過程中接觸的器材，包括燒杯、玻璃棒、pH計(jì)、濾杯、濾膜、流動(dòng)相瓶等。燒杯、玻璃棒是配制流動(dòng)相首先接觸的器材，因此建議配制流動(dòng)相的燒杯、玻璃棒專用。濾杯實(shí)驗(yàn)人員只要清洗干凈一般不會(huì)帶來(lái)污染。需要注意的是，如果過濾含有離子對(duì)的流動(dòng)相，建議增加清洗次數(shù)，避免清洗不干凈污染后續(xù)流動(dòng)相。因此，對(duì)濾杯的清洗應(yīng)該建立基本的洗滌規(guī)程，保證實(shí)驗(yàn)人員對(duì)使用的器材清洗到位。濾膜也是干擾峰引入源頭之一。
如圖3所示，乙腈經(jīng)過有機(jī)系濾膜過濾后，在梯度洗脫中會(huì)引入較大干擾峰。鑒于色譜級(jí)試劑廠家已經(jīng)過膜，且多數(shù)儀器都有脫氣機(jī)，所以筆者建議無(wú)需再對(duì)甲醇、乙腈等純有機(jī)相過濾。流動(dòng)相瓶引入干擾峰的現(xiàn)象主要出現(xiàn)在夏季，這是由于夏季溫度高，純水相容易滋生細(xì)菌。后續(xù)的流動(dòng)相瓶使用人員清洗不到位，所以導(dǎo)致引入干擾峰。因此流動(dòng)相瓶的清洗要建立嚴(yán)格的洗滌規(guī)程。
三、液相系統(tǒng)
異常的色譜峰產(chǎn)生的原因
1、峰前或峰后有小峰的分析
2、負(fù)峰分析
3、前沿、拖尾峰分析
4、色譜雙峰產(chǎn)生的可能及判斷和處理
