一、好氣微生物的分離

    分離的方法很多,大體可分為兩類：一類較為粗放,只能達(dá)到“菌落純”,如稀釋涂布法,劃線分離法,組織分離法等.前兩種方法由于操作簡便有效,工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用較多.組織分離法則通常是從有病或特殊組織中分離菌株.另一類是較細(xì)的單細(xì)胞或單孢子分離方法,可達(dá)到“菌株純”或“細(xì)胞純”的水平.這類方法需采用專門的儀器設(shè)備,復(fù)雜的如顯微操作裝置,簡單的可利用培養(yǎng)皿或凹玻片作分離小室進(jìn)行分離.下面對這幾種分離純化方法分別加以介紹.

 

(一)稀釋涂布法

    把土壤樣品以十倍的級差,用無菌水進(jìn)行稀釋,取一定量的某一稀釋度的懸浮液,涂抹于分離培養(yǎng)基的平板上,經(jīng)過培養(yǎng),長出單個菌落,挑取需要的菌落移到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng).土壤樣品的稀釋程度,要看樣品中的含菌數(shù)多少,一般有機質(zhì)含量高的菜園土等,樣品中含菌量大,稀釋倍數(shù)高些,反之稀釋倍數(shù)低些.采用該方法,在平板培養(yǎng)基上得到單菌落的機會較大,特別適合于分離易蔓延的微生物.

 

(二)劃線分離法

    用接種環(huán)取部分樣品或菌體,在事先已準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基平板上劃線,當(dāng)單個菌落長出后,將菌落移入斜面培養(yǎng)基上,培養(yǎng)后備用.該分離方法操作簡便、快捷,效果較好.

    在樣品含菌量較少或某種目的微生物不多的情況下,微生物的純種分離方法可以簡化如下：第一種方法,取一支盛有3～5ml無菌水的粗試管或小三角瓶,取混勻的樣品少許(0.5g左右)放入其中,充分振蕩分散,用滅菌滴管取一滴土壤懸液于瓊脂平板上涂抹培養(yǎng),或者用接種環(huán)接一環(huán)于平板上劃線培養(yǎng).這種方法不需要菌落計數(shù),比以上常規(guī)稀釋法簡便.第二種方法,取風(fēng)干粉末狀的土樣少許(幾十毫克)直接灑在選擇性分離培養(yǎng)基平板上或混入培養(yǎng)基中制成平板,置適溫培養(yǎng)一定時間,長出菌落.例如分離小單孢菌就可采用該方法,從河泥中取樣,風(fēng)干研碎,取樣品粉末20～50mg直接加到天門冬酰胺培養(yǎng)基中,混合均勻制成平板,培養(yǎng)后長出魚卵狀菌落.這種方法有時分離不夠充分,可用劃線法進(jìn)一步純化.

 

(三)利用平皿的生化反應(yīng)進(jìn)行分離

    這是一種利用特殊的分離培養(yǎng)基對大量混雜微生物進(jìn)行初步分離的方法.分離培養(yǎng)基是根據(jù)目的微生物特殊的生理特性或利用某些代謝產(chǎn)物生化反應(yīng)來設(shè)計的.通過觀察微生物在選擇性培養(yǎng)基上生長狀況或生化反應(yīng)進(jìn)行分離,可顯著提高菌株分離純化的效率.

1. 透明圈法

    在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物,使培養(yǎng)基混濁.能分解底物的微生物便會在菌落周圍產(chǎn)生透明圈,圈的大小初步反應(yīng)該菌株利用底物的能力.該法在分離水解酶產(chǎn)生菌時采用較多,如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶產(chǎn)生菌都會在含有底物的選擇性培養(yǎng)基平板上形成肉眼可見的透明圈.在分離淀粉酶產(chǎn)生菌時,培養(yǎng)基以淀粉為惟一碳源,待樣品涂布到平板上,經(jīng)過培養(yǎng)形成單個菌落后,再用碘液浸涂,根據(jù)菌落周圍是否出現(xiàn)透明的水解圈來區(qū)別產(chǎn)酶菌株.如要分離該酸水解酶產(chǎn)生菌,可用雙層平板法,首先在普通平板培養(yǎng)基上把懸浮液涂抹培養(yǎng),等長出菌落后覆蓋一層營養(yǎng)瓊脂,內(nèi)含3%酵母RNA,0.7%瓊脂及 0.1mol/LEDTA,pH7.0,于42℃左右培養(yǎng)2～4h,四周產(chǎn)生透明圈的菌落,即為核酸分解酶產(chǎn)生菌.

    在分離某種產(chǎn)生有機酸的菌株時,也通常采用透明圈法進(jìn)行初篩.在選擇性培養(yǎng)基中加入碳酸鈣,使平板成混狀,將樣品懸浮液涂抹到平板上進(jìn)行培養(yǎng),由于產(chǎn)生菌能夠把菌落周圍的碳酸鈣水解,形成清晰的透明圈,可以輕易地鑒別出來.分離乳酸產(chǎn)生菌時,由于乳酸是一種較強的有機酸,因此,在培養(yǎng)基中加入的碳酸鈣不僅有鑒別作用,還有酸中和作用.

2. 變色圈法

    對于一些不易產(chǎn)生透明圈產(chǎn)物的產(chǎn)生菌,可在底物平板中加入指示劑或顯色劑,使所需微生物能被快速鑒別出來.如篩選果膠酶產(chǎn)生菌時,用含0.2%果膠為惟一碳源的培養(yǎng)基平板,對含微生物樣品進(jìn)行分離,待菌落長成后,加入0.2%剛果紅溶液染色4h,具有分解果膠能力的菌落周圍便會出現(xiàn)絳紅色水解圈.在分離谷氨酸產(chǎn)生菌時,可在培養(yǎng)基中加入溴百里酚藍(lán),它是一種酸堿指示劑,變色范圍在pH6.2～7.6,當(dāng)pH在6.2以下時為黃色,pH7.6以上為藍(lán)色.若平板上出現(xiàn)產(chǎn)酸菌,其菌落周圍會變成黃色,可以從這些產(chǎn)酸菌中篩選谷氨酸產(chǎn)生菌.

    在進(jìn)行解脂微生物的分離時,雖然有很多精確的測定方法,如酸堿滴定法、電位滴定法、濁度滴定法、甘油滴定法及色譜分析法等,但由于步驟繁瑣,不適于大規(guī)模篩選測定.為提高分離篩選效率,多采用固體平板的變色圈法,如以吐溫為底物,尼羅藍(lán)(Nile blue)作為指示劑,根據(jù)變色圈大小來判斷脂肪酶活性的高低；也可用甘油三丁酸酯為底物,羅丹明B為指示劑,以熒光圈的大小來測定.最常使用的方法是把惡秦染料中的維多利亞藍(lán)和脂類底物混合,制成維多利亞藍(lán)乳脂瓊脂培養(yǎng)基平板,起始培養(yǎng)基調(diào)為中性,當(dāng)土壤樣品的懸濁液分離在平板上,具有脂解能力的菌落產(chǎn)生的脂肪酶水解油脂底物,使pH值由中性下降到微酸性或酸性,陽性解脂反應(yīng)能顯示粉紅到藍(lán)色的變化.如培養(yǎng)基起始pH為堿性,則陽性解脂反應(yīng)從咖啡色到藍(lán)綠色,能使脂類底物和解脂后的脂肪酸區(qū)別開來.后來又由Fryer等研究出一種改良的雙層法,先在平皿內(nèi)倒一層營養(yǎng)瓊脂,把一張棉紙圓片在被維多利亞藍(lán)染了色的乳脂中浸濕,鋪在已凝固的瓊脂表面,然后覆蓋一薄層含樣品的營養(yǎng)瓊脂,保溫培養(yǎng),解脂菌落就可以在棉紙中產(chǎn)生藍(lán)帶.

    分解解脂細(xì)菌的培養(yǎng)基(%)為：牛肉膏0.5、蛋白胨0.5、瓊脂2.0、大豆油5.0、維多利亞藍(lán)4mg.

    分離內(nèi)肽酶產(chǎn)生菌,除了用酪蛋白作底物平板產(chǎn)生透明圈進(jìn)行鑒別外,還可以用吲羥乙酸酯為底物加到分離培養(yǎng)基中,產(chǎn)生蛋白酶的菌落由于水解吲羥乙酸酯為3-羥基吲哚,后者能氧化生成藍(lán)色產(chǎn)物,根據(jù)呈色圈便可選出平板上產(chǎn)蛋白酶的菌落.培養(yǎng)基平板由兩層組成,底層含明膠1.2％,酵母汁0.1％,蛋白胨0.4％,瓊脂1.5％,待凝固后在其上覆蓋一層瓊脂,瓊脂含量為0.7％,由pH7.6的0.5mol/L的磷酸氫鉀緩沖液配制,配制濃度為0.083mol/L的吲羥乙酸酯溶液,取其中的0.3ml加入到上層瓊脂中倒平板.

通過平板上的變色圈還可以快速分離篩選產(chǎn)乙醇的菌株.在以糖為碳源的瓊脂平板的菌落上,覆蓋一層含有鹽類的瓊脂,該藍(lán)色物質(zhì)在醇脫氫酶和NAD作用下(在少量乙醇存在時)反應(yīng)產(chǎn)生的電子脫色.因此生成乙醇的菌落便顯出一個淡白色的圈,暈圈的大小可初步表示乙醇的產(chǎn)量.

3. 生長圈法

    生長圈法通常用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素的產(chǎn)生菌.工具菌是一些相對應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株.將待檢菌涂布于含高濃度的工具菌并缺少所需營養(yǎng)物的平板上進(jìn)行培養(yǎng),若某菌株能合成平板所需的營養(yǎng)物,在該菌株的菌落周圍周圍便會形成一個混濁的生長圈.如嘌呤營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌(如 E.coliP264)與不含嘌呤的瓊脂混合倒平板,在其上涂布含菌樣品保溫培養(yǎng),周圍出現(xiàn)生長圈的菌落即為嘌呤產(chǎn)生菌.

    同樣,只要是篩選微生物所需營養(yǎng)物的產(chǎn)生菌時,都可采用生長圈法,工具菌用 相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株,由于得到所需營養(yǎng),凡是目的微生物周圍便會出現(xiàn)混濁的生長圈.

4. 抑菌圈法

    常用于抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選.通�？股�素的篩選要投入極大的人力、財力和時間.據(jù)估計,篩選1萬個菌株才能得到1株有用的生產(chǎn)菌.因此設(shè)計一個準(zhǔn)確、迅速的篩選模型十分重要.抑菌圈法是常用的初篩方法,工具菌采用抗生素的敏感菌.若被檢菌能分泌某些抑制菌生長的物質(zhì),如抗生素等,便會在該菌落周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈,很容易被鑒別出來.采用該方法已經(jīng)得到很多有用的抗生素,如春雷霉素和青霉素等.

     在青霉素菌種選育中,還可利用加入青霉素酶來篩選青霉素高產(chǎn)菌株,做法如下：將產(chǎn)黃青霉孢子進(jìn)行誘變處理,致死率約為99%.分離于瓊脂平板上,控制孢子濃度,使長成獨立菌落,一直培養(yǎng)到青霉素產(chǎn)量達(dá)到頂峰,加入0.106U/mol青霉素酶于鑒定菌枯草芽孢桿菌懸浮液中,鋪張于菌落平板表面,凝固后,培養(yǎng)17～20h.測量抑菌圈大小,根據(jù)有效指標(biāo)(抑菌圈直徑于菌落直徑之比)選出高產(chǎn)突變株.

    由于現(xiàn)有抗生素種類多樣,得到新的抗生素越來越困難.人們除了從一些特殊的 地方如極端環(huán)境中采樣分離抗生素的產(chǎn)生菌,也采用一些特殊的篩選方法,以期從普通土樣中分離篩選倒新的微生物及新的抗生素.除上述的抑菌圈外,稀釋法、擴散法、生物自顯影法等也不同程度的得到應(yīng)用.在這些方法中,檢驗菌的選擇十分重要,直接關(guān)系到檢出的靈敏度和篩選到的抗生素的活性和抗菌譜.如在篩選抗細(xì)菌抗生素時,傳統(tǒng)上常用金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌作為檢驗菌來檢驗抗生素的抗性.采用聯(lián)合檢驗菌,如枯草桿菌和綠色產(chǎn)色鏈霉菌活巴氏梭菌,可分離出抗菌活性低、對其他試驗菌活性高的新抗生素,如黃色霉素族的抗生素,而這些抗生素在單獨使用枯草桿菌時無法檢出.

    海洋是新抗生素的重要來源.許多海洋生物體內(nèi)都含有微生物,這些微生物為宿主抵御病害起著關(guān)鍵作用.因此,從魚組織和蝦消化道里分離篩選抗癌藥物和抗炎癥藥物是一個有效地途徑.已從水母體內(nèi)篩到一種名為salinamide的抗生素,一種抗真菌抗生素istatin也從海洋生物體中分離出.

    在篩選抗霉菌抗生素時,需根據(jù)其特點進(jìn)行篩選,因霉菌與哺乳動物細(xì)胞性質(zhì)相似,為減少藥物對人體的副作用,需挑選對霉菌有抗性但對人體安全的抗生素.由于哺乳動物不含幾丁質(zhì),因此可先篩選抑制幾丁質(zhì)合成酶的生理活性物質(zhì),再從中篩選所需抗生素.三國霉素和多氧菌素就是通過該方法篩選得到的.抗病毒抗生素及抗腫瘤藥物的篩選則可通過敏感細(xì)菌培養(yǎng)平板的噬菌斑來判斷.

    采用抑菌圈法,不僅能篩選抗生素,而且還能篩選某些酶類.

 

(四)組織分離法

    組織分離法是由一些有病組織或特殊組織中分離菌株的方法.如從患惡苗病的水稻組織中分離赤霉素,從根瘤中分離根瘤菌及從各種食用菌的子實體中分離孢子等.

1. 對一般有病組織的分離方法

    切除小塊含菌組織,用干凈水洗去組織表面污物.以10％漂白粉或0.1％升汞浸泡2～5分鐘進(jìn)行表面消毒,無菌水沖洗.將消毒后的組織移到平皿培養(yǎng)基上,置于適宜溫度(25～26℃)培養(yǎng)一定時間,即可在組織周圍四÷長出微生物.用肉眼或顯微鏡觀察菌落,基本確認(rèn)后挑入斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng).由這種方法挑選的菌株往往不純,必須在瓊脂平板上再分離純化,然后挑取單個菌落于斜面,進(jìn)一步篩選.

    從豆科植物的根瘤中分離根瘤菌：取新鮮健壯的根瘤,經(jīng)漂白粉或升汞溶液等進(jìn)行表面消毒后,用無菌鑷子將根瘤壓破,取出汁液少許與分離培養(yǎng)基混合倒入平皿中,攤平,培養(yǎng)后在平板上長出菌落,經(jīng)鏡檢觀察后確認(rèn)典型菌落,移入斜面.

2.食用菌孢子分離法

    食用菌的孢子分離法通常有兩種,即多孢子分離和單孢子分離.多孢子分離有混雜現(xiàn)象,不易篩選到優(yōu)良穩(wěn)定的菌株.因此,從育種角度最好采用單孢子分離.兩種方法的分離步驟、方法介紹如下：

(1)多孢子分離法

    取產(chǎn)量高、朵大、健壯無病并即將成熟的初生和單生子實體,用清水洗凈表面污物,對子實體外有膜保護(hù)著的菇類,如蘑菇、草菇,在0.1%～0.2%升汞溶液浸泡2～3 min,用無菌水沖洗數(shù)次.對子實體無膜外露的平菇等,不適于用升汞溶液浸泡,要用75%的酒精進(jìn)行表面消毒,再用無菌水沖洗.食用菌的孢子著生在子實體的腹面的菌褶上,成熟時會自動彈出來.孢子采集裝置：用一條兩端彎成鉤的鐵絲,一端鉤著一塊成熟的蠶豆大子實體,另一端掛在三角瓶的瓶口上.三角瓶內(nèi)事先制備好馬鈴薯—蔗糖培養(yǎng)基平板.懸掛的子實體距離培養(yǎng)基平板2～3cm.適溫培養(yǎng)1～2天,就有孢子陸續(xù)彈落于三角瓶底部的培養(yǎng)基上,經(jīng)過4～5天,孢子萌芽成菌絲,及時將菌絲尖端接入到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng),然后進(jìn)行生產(chǎn)性能對比試驗.

(2)單孢子分離法

    取一條鐵絲,彎曲成蚊香支架形狀,放在已消毒的玻璃板上.將消毒后的子實體懸掛在支架上方,下方置一個已滅菌的去蓋的培養(yǎng)皿,然后罩一個鐘罩,周圍縫隙用凡士林封好.將這套孢子收集器移到恒溫室內(nèi)培養(yǎng)1～2天,將有大量孢子彈到平皿上,收集孢子.以上操作全部在超凈臺或無菌室內(nèi)進(jìn)行.將收集到的孢子用稀釋法在馬鈴薯—蔗糖培養(yǎng)基平板上進(jìn)行單孢子分離,培養(yǎng)后把單孢子長出的菌落移接到斜面上,進(jìn)行生產(chǎn)性能比較試驗.

 

(五)單細(xì)胞或單孢子分離法

    采用特殊的儀器設(shè)備進(jìn)行單細(xì)胞或單孢子的分離.具體方法有多種,現(xiàn)主要介紹檸檬酸產(chǎn)生菌采用的小滴分離純化方法.操作如下：將待純化的孢子懸液稀釋約為1500ml-1,用校正口徑的滴管(每毫升400滴)吸取孢子并均勻滴于無菌干燥蓋玻片上,將其小心翻轉(zhuǎn)于凹玻片的孔穴上,穴內(nèi)加一滴已滅菌的培養(yǎng)液,蓋玻片和載玻片用凡士林密封.顯微鏡下觀察每個小滴,將只有一個孢子的小滴位置作好記錄,恒溫培養(yǎng),挑取單菌落于斜面.

除用凹玻片,還可用濾紙進(jìn)行單細(xì)胞或單孢子分離.具體作法如下：取與皿內(nèi)徑大小一致的濾紙3～4層,浸在培養(yǎng)液中,取出放在空皿內(nèi),在濾紙上滴幾滴甘油以防干燥,蓋好皿蓋,滅菌.將稀釋為1500ml-1的孢子懸液用上述滴管滴在濾紙上,每皿約點20點滴左右,經(jīng)恒溫培養(yǎng),每滴約出現(xiàn)10個菌落,將單菌落移接于斜面上.該方法能夠得到單細(xì)胞或單孢子,較為精確,但操作時要細(xì),否則不易得到理想結(jié)果.

 

(六)特殊菌類——環(huán)保降解菌的分離

    自然界存在著大量廢物及污染物,如多環(huán)芳烴(PAHs)、有機染料和顏料、表面活性劑、農(nóng)藥、酚類和鹵代烴等.在分離篩選這類物質(zhì)的降解微生物由于該物質(zhì)為唯一碳源或氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng).不能利用該物質(zhì)的微生物由于得不到營養(yǎng)被淘汰,能分解該物質(zhì)的微生物則正常生長.經(jīng)過幾個月的連續(xù)培養(yǎng)后,將富集培養(yǎng)液劃線或涂布于分離平板上,便能篩選到所需的環(huán)保降解菌株.分離平板可采用該污染物為底物的鑒別培養(yǎng)基,通過水解圈變色圈進(jìn)一步提高篩選效率.

    采用該方法分離苯胺、DDT、甲基對硫磷(MP)石油、甲胺磷等污染物都取得了良好的效果.如王倩如等人從經(jīng)甲胺磷農(nóng)藥廢水長期馴化的活性污泥中,篩選到能高效降解甲胺磷農(nóng)藥的蠟狀芽孢桿菌(Bacillus crerus)和嗜中溫假單孢菌(Pseudomonas mesophilica),兩株混合菌對有機磷的去除率達(dá)99.7%.