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一、接種
將微生物接到適于它生長(zhǎng)繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過(guò)程叫做接種.
1、接種工具和方法
在實(shí)驗(yàn)室或工廠實(shí)踐中,用得最多的接種工具是接種環(huán)、接種針.由于接種要求或方法的不同,接種針的針尖部常做成不同的形狀,有刀形、耙形等之分.有時(shí)滴管、吸管也可作為接種工具進(jìn)行液體接種.在固體培養(yǎng)基表面要將菌液均勻涂布時(shí),需要用到涂布棒.(圖3-3)
圖3-3 接種和分離工具
1.接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀
常用的接種方法有以下幾種：
1)劃線接種 這是最常用的接種方法.即在固體培養(yǎng)基表面作來(lái)回直線形的移動(dòng),就可達(dá)到接種的作用.常用的接種工具有接種環(huán),接種針等.在斜面接種和平板劃線中就常用此法.
2)三點(diǎn)接種 在研究霉菌形態(tài)時(shí)常用此法.此法即把少量的微生物接種在平板表面上,成等邊三角形的三點(diǎn),讓它各自獨(dú)立形成菌落后,來(lái)觀察、研究它們的形態(tài).除三點(diǎn)外,也有一點(diǎn)或多點(diǎn)進(jìn)行接種的.
3)穿刺接種 在保藏厭氧菌種或研究微生物的動(dòng)力時(shí)常采用此法.做穿刺接種時(shí),用的接種工具是接種針.用的培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基.它的做法是：用接種針蘸取少量的菌種,沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺,如某細(xì)菌具有鞭毛而能運(yùn)動(dòng),則在穿刺線周?chē)軌蛏L(zhǎng).
4)澆混接種 該法是將待接的微生物先放入培養(yǎng)皿中,然后再倒入冷卻至45°C左右的固體培養(yǎng)基,迅速輕輕搖勻,這樣菌液就達(dá)到稀釋的目的.待平板凝固之后,置合適溫度下培養(yǎng),就可長(zhǎng)出單個(gè)的微生物菌落.
5)涂布接種 與澆混接種略有不同,就是先倒好平板,讓其凝固,然后再將菌液倒入平板上面,迅速用涂布棒在表面作來(lái)回左右的涂布,讓菌液均勻分布,就可長(zhǎng)出單個(gè)的微生物的菌落.
6)液體接種 從固體培養(yǎng)基中將菌洗下,倒入液體培養(yǎng)基中,或者從液體培養(yǎng)物中,用移液管將菌液接至液體培養(yǎng)基中,或從液體培養(yǎng)物中將菌液移至固體培養(yǎng)基中,都可稱(chēng)為液體接種.
7)注射接種 該法是用注射的方法將待接的微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi),如人或其它動(dòng)物中,常見(jiàn)的疫苗預(yù)防接種,就是用注射接種,接入人體,來(lái)預(yù)防某些疾病.
8)活體接種 活體接種是專(zhuān)門(mén)用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法,因?yàn)椴《颈仨毥臃N于活的生物體內(nèi)才能生長(zhǎng)繁殖.所用的活體可以是整個(gè)動(dòng)物；也可以是某個(gè)離體活組織,例如猴腎等；也可以是發(fā)育的雞胚.接種的方式是注射,也可以是拌料喂養(yǎng).
2、無(wú)菌操作
培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后,用經(jīng)過(guò)滅菌的工具(如接種針和吸管等)在無(wú)菌條件下接種含菌材料(如樣品、菌苔或菌懸液等)于培養(yǎng)基上,這個(gè)過(guò)程叫做無(wú)菌接種操作.在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無(wú)菌操作.
實(shí)驗(yàn)臺(tái)面不論是什么材料,一律要求光滑、水平.光滑是便于用消毒劑擦洗；水平是倒瓊脂培養(yǎng)基時(shí)利于培養(yǎng)皿內(nèi)平板的厚度保持一致.在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上方,空氣流動(dòng)應(yīng)緩慢,雜菌應(yīng)盡量減少,其周?chē)s菌也應(yīng)越少越好.為此,必須清掃室內(nèi),關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室的門(mén)窗,并用消毒劑進(jìn)行空氣消毒處理,盡可能地減少雜菌的數(shù)量.
空氣中的雜菌在氣流小的情況下,隨著灰塵落下,所以接種時(shí),打開(kāi)培養(yǎng)皿的時(shí)間應(yīng)盡量短.用于接種的器具必須經(jīng)干熱或火焰等滅菌.接種環(huán)的火焰滅菌方法：通常接種環(huán)在火焰上充分燒紅(接種柄,一邊轉(zhuǎn)動(dòng)一邊慢慢地來(lái)回通過(guò)火焰三次),冷卻,先接觸一下培養(yǎng)基,待接種環(huán)冷卻到室溫后,方可用它來(lái)挑取含菌材料或菌體,迅速地接種到新的培養(yǎng)基上.(圖3-4)然后,將接種環(huán)從柄部至環(huán)端逐漸通過(guò)火焰滅菌,復(fù)原.不要直接燒環(huán),以免殘留在接種環(huán)上的菌體爆濺而污染空間.平板接種時(shí),通常把平板的面傾斜,把培養(yǎng)皿的蓋打開(kāi)一小部分進(jìn)行接種.在向培養(yǎng)皿內(nèi)倒培養(yǎng)基或接種時(shí),試管口或瓶壁外面不要接觸底皿邊,試管或瓶口應(yīng)傾斜一下在火焰上通過(guò).
二、分離純化
含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱(chēng)為混和培養(yǎng)物(Mixed culture).如果在一個(gè)菌落中所有細(xì)胞均來(lái)自于一個(gè)親代細(xì)胞,那么這個(gè)菌落稱(chēng)為純培養(yǎng)(Pure culture).在進(jìn)行菌種鑒定時(shí),所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物.得到純培養(yǎng)的過(guò)程稱(chēng)為分離純化,方法有許多種.
1、傾注平板法
首先把微生物懸液通過(guò)一系列稀釋,取一定量的稀釋液與熔化好的保持在40~50°左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基充分混合,然后把這混合液傾注到無(wú)菌的培養(yǎng)皿中,待凝固之后,把這平板倒置在恒箱中培養(yǎng).單一細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次增殖后形成一個(gè)菌落,取單個(gè)菌落制成懸液,重復(fù)上述步驟數(shù)次,便可得到純培養(yǎng)物.(圖 3-5,a)
2、涂布平板法
首先把微生物懸液通過(guò)適當(dāng)?shù)南♂?取一定量的稀釋液放在無(wú)菌的已經(jīng)凝固的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上,然后用無(wú)菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面上,經(jīng)恒溫培養(yǎng)便可以得到單個(gè)菌落.(圖3-5,b)
3、平板劃線法
最簡(jiǎn)單的分離微生物的方法是平板劃線法.用無(wú)菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物少許在平板上進(jìn)行劃線.劃線的方法很多,常見(jiàn)的比較容易出現(xiàn)單個(gè)菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等.(圖3-6)當(dāng)接種環(huán)在培養(yǎng)基表面上往后移動(dòng)時(shí),接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋,最后在所劃的線上分散著單個(gè)細(xì)胞,經(jīng)培養(yǎng),每一個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)成一個(gè)菌落.(圖3-7)
4、富集培養(yǎng)法
富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡(jiǎn)單.我們可以創(chuàng)造一些條件只讓所需的微生物生長(zhǎng),在這些條件下,所需要的微生物能有效地與其他微生物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng),在生長(zhǎng)能力方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他微生物.所創(chuàng)造的條件包括選擇最適的碳源、能源、溫度、光、pH、滲透壓和氫受體等.在相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下,經(jīng)過(guò)多次重復(fù)移種,最后富集的菌株很容易在固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出單菌落.如果要分離一些專(zhuān)性寄生菌,就必須把樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細(xì)胞群體中,使其大量生長(zhǎng).通過(guò)多次重復(fù)移種便可以得到純的寄生菌.
5、厭氧法
在實(shí)驗(yàn)室中,為了分離某些厭氧菌,可以利用裝有原培養(yǎng)基的試管作為培養(yǎng)容器,把這支試管放在沸水0浴中加熱數(shù)分鐘,以便逐出培養(yǎng)基中的溶解氧.然后快速冷卻,并進(jìn)行接種.接種后,加入無(wú)菌的石蠟于培養(yǎng)基表面,使培養(yǎng)基與空氣隔絕.另一種方法是,在接種后,利用N2或CO2取代培養(yǎng)基中的氣體,然后在火焰上把試管口密封.有時(shí)為了更有效地分離某些厭氧菌,可以把所分離的樣品接種于培養(yǎng)基上,然后再把培養(yǎng)皿放在完全密封的厭氧培養(yǎng)裝置中.
三、培養(yǎng)
微生物的生長(zhǎng),除了受本身的遺傳特性決定外,還受到許多外界因素的影響,如營(yíng)養(yǎng)物濃度、溫度、水分、氧氣、PH等.微生物的種類(lèi)不同,培養(yǎng)的方式和條件也不盡相同.
1、影響微生物生長(zhǎng)的因素
微生物的生長(zhǎng),除了受本身的遺傳特性決定外,還受到外界許多因素的影響.影響微生物生長(zhǎng)的因素很多,簡(jiǎn)要介紹如下.
1) 營(yíng)養(yǎng)物濃度
細(xì)菌的生長(zhǎng)率與營(yíng)養(yǎng)物的濃度有關(guān)：μ=μmax*C/(K+C)
營(yíng)養(yǎng)物濃度與生長(zhǎng)率的關(guān)系曲線是典型的雙曲線.
K值是細(xì)菌生長(zhǎng)的很基本的特性常數(shù).它的數(shù)值很小,表明細(xì)菌所需要的營(yíng)養(yǎng)濃度非常之低,所以在自然界中,它們到處生長(zhǎng).然而營(yíng)養(yǎng)太低時(shí),細(xì)菌生長(zhǎng)就會(huì)遇到困難,甚至還會(huì)死亡.這是因?yàn)槌松L(zhǎng)需要能量以外,細(xì)菌還需要能量來(lái)維持它的生存.這種能量稱(chēng)為維持能.另一方面,隨著營(yíng)養(yǎng)物濃度的增加,生長(zhǎng)率愈接近最大值.
2)溫度
在一定的溫度范圍內(nèi),每種微生物都有自已的生長(zhǎng)溫度三基點(diǎn)：最低生長(zhǎng)溫度、最適生長(zhǎng)溫度和最高生長(zhǎng)溫度.在生長(zhǎng)溫度三基點(diǎn)內(nèi),微生物都能生長(zhǎng),但生長(zhǎng)速率不一樣.微生物只有處于最適生長(zhǎng)溫度時(shí),生長(zhǎng)速度才最快,代時(shí)最短.超過(guò)最低生長(zhǎng)溫度,微生物不會(huì)生長(zhǎng),溫度太低,甚至?xí)劳?超過(guò)最高生長(zhǎng)溫度,微生物也要停止生長(zhǎng),溫度過(guò)高.也會(huì)死亡.一般情況下,每種微生物的生長(zhǎng)溫度三基點(diǎn)是恒定的.但也常受其它環(huán)境條件的影響而發(fā)生變化.
根據(jù)微生物最適生長(zhǎng)溫度的不同,可將它們分為三個(gè)類(lèi)型：
a.嗜冷微生物：其是適生長(zhǎng)溫度多數(shù)在-10℃-20℃之間
b.中溫微生物：其最適生長(zhǎng)溫度一般在20℃-45℃之間
c.嗜熱微生物：生長(zhǎng)溫度在45℃以上.
3)水分
水分是微生物進(jìn)行生長(zhǎng)的必要條件.芽孢、孢子萌發(fā),首先需要水分.微生物是不能脫離水而生存的.但是微生物只能在水溶液中生長(zhǎng),而不能生活在純水中.各種微生物在不能生長(zhǎng)發(fā)育的水分活性范圍內(nèi),均具有狹小的適當(dāng)?shù)乃只钚詤^(qū)域.
