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無菌操作知識培訓教材

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2023-08-30
核心提示: 一、無菌操作要求 微生物實驗室工作人員,必須有嚴格的無菌觀念,許多實驗要求在無菌的條件下進行,主要原因,一是防
 一、無菌操作要求

 

微生物實驗室工作人員,必須有嚴格的無菌觀念,許多實驗要求在無菌的條件下進行,主要原因,一是防止試驗操作中人為污染樣品,二是保證工作人員安全,防止檢出的致病菌由于操作不當造成個人污染。要求如下:

1.1  接種細菌時必須穿工作服、帶工作帽;

1.2  進行接種食品樣品時,必須穿專用的工作服、帽及拖鞋,應放在無菌室緩沖間,工作前經紫外線消毒后使用;

1.3  接種食品樣品時,應在進無菌室前用肥皂洗手,然后用酒精棉球將手擦干凈;

1.4  進行接種所用的吸管、平皿及培養(yǎng)基等必須經消毒滅菌,打開包裝未使用完的器皿,不能放置后再使用,金屬用具應高壓滅菌或用酒精點燃燒灼三次后使用;

1.5  從包裝中取出吸管時,吸管尖部不能觸及試管或平皿邊;

1.6  接種樣品、轉種細菌必須在酒精燈前操作,接種細菌活樣品時,吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒;

1.7  接種環(huán)和針在接種細菌前應經火焰燒灼全部金屬絲,必要時還要燒到針和環(huán)與桿的連接處,接種結核菌和烈性菌的接種環(huán)應在沸水中煮沸5min,再經火焰燒灼;

1.8  吸管吸取菌液或樣品時,應用相應的橡皮頭吸取,不得直接用口吸。

 

二、無菌間使用要求

2.1 無菌間應密封,不得隨意打開,并設有與無菌間大小相應的緩沖間及門,另盡量設有的小窗,以備進入無菌間后傳遞物品。

2.2  無菌間應保持清潔,工作后用煤酚皂液溶液消毒,擦拭工作臺面,不得存放與試驗無關的物品;

2.3  無菌間使用前后應將門關緊,打開紫外燈,如采用室內懸掉紫外燈消毒時,需30W紫外燈,距離工作臺1m處,照射時間不少于30分鐘,使用紫外燈,應注意不得直接在紫外線下操作,以免引起損傷,燈管每隔兩周需用酒精球輕輕擦拭,除去上面的灰塵和油垢,以減少紫外線穿透的影響;

2.4  處理和接種食品標本時,進入無菌間操作,不得隨意出入,如需要傳遞物品,可通過小窗傳遞;

2.5  在無菌間需用安裝空調時,則應有過濾裝置。

 

三、消毒滅菌要求

微生物檢測用的玻璃器皿、金屬用具及培養(yǎng)基、被污染和接種的培養(yǎng)物等,必須經滅菌后方能使用。

3.1  滅菌前準備

3.1.1  所有需經滅菌的物品首先要清洗晾干,玻璃器皿如吸管、平皿用紙包裝嚴密,如用金屬筒應將上面氣孔打開。

3.1.2  裝培養(yǎng)基的三角瓶塞好棉塞,用紙包好,試管蓋好蓋,注射器須將管芯抽出,用紗布包好。

3.2  裝放

3.2.1  大型高壓蒸氣鍋:放置滅菌物品不應超過鍋內容積的80%,物品應放置鍋內擱架上或鐵絲筐中。

3.2.2  手提式高壓鍋:將物品分別包扎好,直接放入消毒筒內,物品之間不能過擠。

3.3  設備檢查

3.3.1  檢查門的開關是否靈活,橡皮圈有無損壞,是否平整。

3.3.2  壓力表蒸氣排盡時是否停留在零位,關好門和蓋,通蒸氣或加熱后,觀察是否漏氣,壓力表與溫度計所標示的狀況是否吻合,管道有無堵塞。

3.3.3  對有自動電子程序控制裝置的滅菌器,使用前應檢查規(guī)定的程序,是否符合于進行滅菌處理的要求。

3.4  滅菌處理

手提式高壓鍋或立式壓力蒸氣滅菌器的使用應按下列步驟進行:

3.4.1  手提式高壓鍋在主體內加入3L清水,立式高壓鍋加水16L(重復使用時應將水量補足,水變混濁需要更換)。

3.4.2  手提式壓力鍋將頂蓋上的排氣管插入消毒桶內壁的方管中(無軟管或軟管銹蝕破裂的滅菌器不得使用)。

3.4.3  蓋好頂蓋擰緊,勿使漏氣;置滅菌器于火源上加熱,立式壓力鍋通上電源,并打開頂蓋上的排氣閥放出冷氣(水沸騰后排氣10~15min)。

3.4.4  關閉排氣閥,使蒸氣壓上升到規(guī)定要求,并維持規(guī)定時間(按滅菌物品性質與有關情況而定)。

3.4.5  達到規(guī)定時間后,對需干燥的物品,立即打開排氣閥排出蒸汽,待壓力恢復到零時,自然冷卻至60℃后開蓋取物,如為液體物品,不要打開排氣閥,而應立即將鍋去除熱源,待自然冷卻,壓力恢復至零,溫度降到60℃以下再打開蓋取物,以防止突然減壓液體劇烈沸騰活容器爆破。

3.5 滅菌溫度與時間

3.5.1壓力蒸氣滅菌鍋滅菌溫度與時間見下表:


 

3.5.2  滅菌處理:滅菌后物品,劑等,應檢查是否符合達到滅菌后的色澤或狀態(tài),未達到者應廢棄。

3.5.3  取出的物品掉落在地或誤放不潔之處,或沾有水液,均視為受到污染,不可作為無菌物品使用。

3.5.4  取出的合格滅菌物品,應存放于貯藏室或防塵柜內,嚴禁與未滅菌物品混放。

3.5.5  凡屬合格物品,應標有滅菌日期及有效期限。

3.5.6  每批滅菌處理完成后,記錄滅菌品名、數量、溫度、時間、操作者。

 

四、有毒有菌污物處理要求

微生物實驗室所用實驗器材、培養(yǎng)物等未經消毒處理,一律不得帶出實驗室。

4.1  經培養(yǎng)的污染材料及廢棄物應放在嚴密的容器或鐵絲筐內,并集中存放在指定地點,待統(tǒng)一進行高壓滅菌。

4.2  經微生物污染的培養(yǎng)物,必須經121℃,30min高壓滅菌。

4.3  染菌后的吸管,使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸溶液中,最少浸泡24小時,再經121℃,30min高壓滅菌。

4.4  涂片染色沖洗片的液體,一般可直接沖入下水道,染色的玻片放入5%煤酚皂液中浸泡24h后,煮沸洗滌。做凝集試驗用的玻片或平皿,必須經高壓滅菌后洗滌。

4.5  打碎的培養(yǎng)物,立即用5%煤酚皂液或石炭酸噴灑和浸泡被污染部位,浸泡半小時后再擦拭干凈。

4.6  污染的工作服或進行烈性菌試驗所穿的工作服、帽、口罩等,應放入專用消毒袋內,經高壓滅菌后方能洗滌。

 

五、玻璃器皿的清洗要求

5.1 目的  

為了保證微生物實驗順利進行,保證實驗結果的準確性,不影響實驗進度,必須把器皿徹底清洗干凈。

5.2  注意事項

5.2.1  任何洗滌方法,都不應對玻璃器皿有所損傷,不能用有腐蝕作用的化學藥劑,也不能使用比玻璃器皿硬度大的物品來擦拭玻璃器皿。

5.2.2  一般新的玻璃器皿用2%的鹽酸液浸泡數小時,后用水沖洗干凈。

5.2.3  用過的器皿應立即洗滌,放置太久會增加洗滌困難。

5.2.4  強酸、強堿及其它氧化物和有揮發(fā)性的有毒物品,都不能倒在洗滌槽內,以免污染環(huán)境水質,必須倒在廢水缸中。

5.2.5  含有對人體有傳染性病菌的器具,應先煮沸滅菌后再進行洗滌。

5.2.6  難洗滌的器皿不要與易洗滌的器皿放在一起,以免增加洗滌的麻煩。有油的器皿不要與無油的器皿混在一起,否則使本來無油的器皿沾上了油垢,浪費藥劑和時間。

5.3  洗滌劑的種類:

水、洗衣粉、檸檬洗滌劑、肥皂

5.4  洗滌方法

5.4.1  含有瓊脂培養(yǎng)基的玻璃器皿的洗滌方法:事先應將器皿中的瓊脂刮去,然后用清水洗滌,并用試管刷刷其瓶壁,以除去粘污在壁上的灰塵和油垢。用洗衣粉水洗去油污,然后用自來水沖洗。洗好后的器皿應倒置晾干或置于干燥箱中干燥至無水滴。

5.4.2  載玻片及蓋玻片的洗滌法:新載玻片及蓋玻片先在20%的鹽酸溶液中浸一小時,然后用自來水沖洗2~3次,最后用蒸餾水換洗2~3次。用過的載玻片及蓋玻片,應用紙擦去油垢,再放在5%的洗衣粉水中煮30分鐘后立即用自來水沖洗,然后放在稀的洗液中浸泡2小時,再用自來水沖洗至中性。

5.4.3  移液管、倒管的洗滌方法:新的移液管及倒管先在的5%鹽酸溶液中浸一小時,然后用自來水沖洗幾次,最后用蒸餾水換洗幾次。用過的移液管、倒管先用自來水洗去表面的殘液,再放在洗衣粉水中浸泡一小時以上,再用自來水沖洗至管內壁無殘渣,最后用蒸餾水換洗次,晾干后入恒溫干燥箱中烘干。

 

六、培養(yǎng)基、無菌水的制備

6.1  基本原理

培養(yǎng)基的種類很多,不同微生物所需要的培養(yǎng)基不同。培養(yǎng)基制成后的物理狀態(tài)可分為液體、固體、半固體三種類型。

6.2  器材

三角瓶、試管、燒杯、玻棒、天平、搪瓷杯、量筒、鋁箔紙、角匙、杜氏小管、硅膠塞、電爐

6.3  培養(yǎng)基的種類

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(附加抗菌素)、平板計數瓊脂、月桂基硫酸鹽胰蛋白凍肉湯、煌綠乳糖膽鹽肉湯、EC肉湯、高鹽察氏瓊脂、三糖鐵瓊脂等

6.4  方法步驟

6.4.1  培養(yǎng)基的制備:

6.4.2  稱量:根據培養(yǎng)基的配方,稱取適量藥品于搪瓷杯中;

6.4.3  溶解:用量筒量取所需水量,置電爐上加熱,一邊攪拌,至完全溶解,加熱至沸騰,拔掉電源,待冷卻;

6.4.4  分裝:根據不同需要,立即趁熱分裝入三角瓶或試管中,分裝三角瓶以不超過三角瓶一半為宜,分裝試管一般為管長的1/5(需根據試管的大小而定)。液體培養(yǎng)基如乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基約分裝10毫升左右。

6.4.5  塞硅膠塞:裝好培養(yǎng)基的試管應塞上硅膠塞,松緊合適,緊貼管壁,不留縫隙,約1/2塞入內,這樣即可過濾空氣,避免雜菌侵入,又可減緩培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)。

6.4.6  包裝:三角瓶棉塞頭部應用錫箔紙包扎,試管集中于試管簍。

6.5  無菌水的制備:

6.5.1  用10ml移液管量取9.2ml蒸餾水(稀釋水)裝入試管中。

6.5.2  用100ml量筒量取95ml蒸餾水(稀釋水)裝入150ml的三角瓶中?芍蒙僭S玻璃珠于三角瓶內,防止暴沸。

6.5.3  量取240ml蒸餾水(稀釋水)于250ml的三角瓶中,塞上瓶塞用牛皮紙包扎好,高壓滅菌備用。

 

七、設備使用原則

7.1  實驗設備的使用由實驗員嚴格按照操作說明書進行,其他人員不得隨意操作。

7.2  實驗設備的日常維護保養(yǎng)由實驗員根據設備操作說明書進行,出現(xiàn)不可排除的故障時,經部門總經理批準,商請專業(yè)人員維修。

7.3  實驗設備應定期進行計量檢測,確保儀器的準確性。

7.4  實驗員應愛護儀器設備,使用前應檢查,使用后應及時清理清潔,并定期維護保養(yǎng),下班前應檢查設備電源是否關閉。

編輯:songjiajie2010

 
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