在水溶液中，pH值被校準以提供正確的pH值——你需要確認的緩沖液是水溶液。如果你用添加了有機相的水溶液來測量pH值，pH值就會與有機相添加前的pH值不同。

然而，最重要的一點是要保持一致。如果你總是在添加有機相后測量pH值，確保你在方法中說明了這一點，以便每個人都用同樣的方法。它不會百分百準確，但至少會是一致的。這可能比精確的pH值更重要。

緩沖液是用來控制pH值和抵抗pH值變化的。方法的許多其他部分(例如樣品基質(zhì)、空氣中的二氧化碳、流動相中水的來源)可以改變流動相的pH值，從而導(dǎo)致保留、峰形和峰值響應(yīng)的變化。甲酸，三氟乙酸等不屬于緩沖試劑。

每個緩沖鹽有2個pH值單位范圍，它提供了最佳的pH穩(wěn)定性。在緩沖范圍外面，鹽對pH值的變化是無效的。要么在正確的范圍內(nèi)使用緩沖區(qū)，要么選擇一個范圍覆蓋所需pH值的緩沖區(qū)。

將水的緩沖液混合到有機相中，會導(dǎo)致緩沖液沉淀的高風險——在許多情況下，變化微小，以至于可能不太明顯。常常是將有機物質(zhì)添加到水相，這大大降低了緩沖沉淀的風險。

現(xiàn)代泵在混合流動相和在線脫氣上非常有效，然而，并不是每個使用你的方法的人都有一個高質(zhì)量的泵。預(yù)混合你的A和B，混合成一個單一的溶液，在A管路上100%運行。

將950mL的水溶液與50mL的有機溶液混合，然后過濾和脫氣。這降低了HPLC之間的可變性，降低了系統(tǒng)中氣泡和沉降的風險。

注意，在泵上混合的95:5不會和在瓶中預(yù)拌的95:5相同的保留時間——你通常需要在預(yù)混合時添加更多的有機成分。

只使用你正在使用的緩沖鹽的酸或堿。舉例來說，磷酸鈉緩沖液應(yīng)該僅用磷酸或氫氧化鈉來調(diào)節(jié)。

例如，將5g的磷酸鈉放入1000ml的水中

緩沖劑的類型(單鹽基，二鹽基，三鹽基)決定了它的pH緩沖范圍。

所需的質(zhì)量濃度決定了緩沖強度。5g無水磷酸氫鈉和5g一水合磷酸氫鈉會有不同的緩沖強度，并會影響到保留。

如果前一種方法在B管路中使用了緩沖液，而你的方法在B管路中使用了有機相，那么緩沖液很有可能會在你的泵管路/泵頭中沉淀。我在早期就這樣做了，并且造成了很大的傷害。如果有懷疑——把它沖出來(用80:20水:有機相)。

如果沒有足夠的流動相來完成運行——將有50%的可能性，氣體將會在最后幾個樣品的中運行。除了磨損你的泵和色譜柱走干的風險，流動相從表面蒸發(fā)，所以在瓶子頂部的流動相與大多數(shù)體積相比成分將會改變。如果你使用瓶子里的最后少量的流動相，頂部的這個部分恰好是貫穿柱子的東西。

這對確保你所有的緩沖鹽溶解都很好，但這是最不有效的脫氣方法，它會迅速加熱流動相，導(dǎo)致有機部分蒸發(fā)。節(jié)省你日后的問題——用5分鐘的時間來過濾你的流動相——它會在一個步驟中脫氣和過濾。