一、目的與要求：

1、明確測定各類色素的原理與方法。

2、通過此實驗掌握紙層析定性法與提純色素的定量法。

二、原理：

    聚酰胺是具有二極性的化合物，水溶性酸性染料在酸性條件下被聚酰胺吸附，而在堿性條件下解吸附，再用紙色譜法或薄層色譜法進行分離后與標準比較定性、定量。

    三、試劑：

    1、聚酰胺粉(尼龍6)

2、硫酸1：1 0

3、甲醇—甲酸溶液：6：4

4、甲醇

5、20％檸檬酸溶液

6、10％鎢酸鈉溶液

    7、石油醚：沸程60-90℃

    8、海砂：先用l：10鹽酸煮沸15min，用水洗中性，再用5％氫氧化鈉溶液煮沸15min，再于105℃干燥，貯于具玻璃塞的瓶中，備用。

    9、乙醇-氨溶液：取1毫升氨水，加70％乙醇至100毫升。

10、50％ 乙醇溶液

11、硅膠G。

12、PH6的水：用20％檸檬酸調節(jié)至PH 6。

13、鹽酸: 1：10

14、5％氫氧鈉溶液

15、碎瓷片：處理方法同海砂

16、展開劑

    a、正丁醇-無水乙醇-1％氨水(6：2：3)：供紙色譜用。

    b、正丁醇-吡啶-1％氨水(6：3：4)：供紙色譜用。

    c、甲乙酮-丙酮-水(7：3：3)：供紙色譜用。

    d、甲醇-乙二胺-氨水(10：3：2)：供薄層色譜用。

    e、甲醇-氨水-乙醇(5：1：10)：供薄層色譜用。

    f、2.5％檸檬酸鈉-氨水-乙醇(8：1：2)供薄層色譜用。

    17、色素標準溶液{以下商品作為標準以100％計。

    胭脂紅：純度60％；莧菜紅：純度60％；檸檬黃：純度60%；靛藍：純度40％；日落黃：純度60％，亮藍；純度60％。

    精密稱取上述色素各0.100克，用PH6的水溶解，移入100毫升容量瓶中并稀釋至刻度。此溶液每毫升相當于1毫克商品色素。靛藍溶液需在暗處保存。

    18、色素標準使用液：用時吸取色素標準溶液各5.0毫升，分別置于50毫升容量瓶中，加PH6的水稀釋至刻度。此溶液每毫升相當于0.1毫克商品色素。

四、儀器：

1、分光光度計

2、微量注射器或色素吸管

3、展開槽，25 X 6 x 4cm

4、層析缸

5、濾紙、中速濾紙，紙色譜用

6、薄層板：5 X 20em

    7、電吹風機

    8、水泵

    五、操作方法：

    1、樣品處理

    A、果味水、果子露、汽水：吸取50.0毫升樣品于100毫升燒杯中，汽水需加熱驅除二氧化碳。

    B、配制酒：吸取100.0毫升樣品于燒杯中，加碎瓷片數塊，加熱驅除乙醇。

    C、硬糖：蜜餞類，淀粉軟糖：稱取5.0或10.0克粉碎的樣品，加30毫升水，溫熱溶解，若樣液PH值較高，用20％檸檬酸溶液調至PH4左右。

    D、含蛋奶的樣品

    (1)奶糖：稱取10.0克粉碎均勻的樣品，加30毫升乙醇-氨溶液溶解，置水浴上濃縮至約20毫升，立即用1：10硫酸調溶液至微酸隆再加1.0毫升1：l0硫酸，加1毫升l0％鎢酸鈉溶液，使蛋白質沉淀，過濾，用少量水洗滌，收集濾液。

    (2)蛋糕類：稱取10.0克粉碎均勻的樣品，加海砂少許，混勻、用熱風風干樣品(用手摸已干燥即可以)，加入30毫升石油醚攪拌，放置片刻，傾出石油醚，如此重復處理三次，以除去脂肪吹干后研細，全部轉人G3垂融漏斗或普通漏斗中，用乙醇—氨溶液提取色素，直至色素全部提完以下按(1)自“置水浴下濃縮至約20毫升”起依法操作。

    2、吸附分離

    將處理后所得的溶液加熱至70℃，加入0.5-1.0克聚酰胺粉充分攪拌，用20％檸檬酸溶液調PH至4，使色素完全被吸附，若溶液還有顏色，可以再加一些聚酰胺粉。將吸附色素的聚酰胺全部轉入G3垂融漏斗或玻璃漏斗中過濾(如用G3垂融漏斗過濾，可以用水泵慢慢地抽濾)。用20％檸檬酸酸化PH＝4的70℃水反復洗滌，每次20毫升，邊洗邊攪拌，若含有天然色素再用甲醇-甲酸溶液洗滌1-3次，每次20毫升，至洗液無色為止。再用70℃水多次洗滌至流出的溶液為中性。洗滌過程中必須充分攪拌。然后用乙醇-氨溶液分次解吸全部色素，收集全部解吸液，于水浴上驅氨。如果為單色，則用水準確稀釋至50毫升，用分光光度法進行測定。如果為多種色素混合液，則進行紙色譜或薄層色譜法分離后測定，即將上述溶液置水浴上濃縮至約2毫升后移人5毫升容量瓶中，用50％乙醇洗滌容器，洗液并入容量瓶中并稀釋至刻度。

    3、定性

    A、紙色譜

    取色譜用紙，在距底邊2cm的起始線上分別點3-10微升樣品溶液，1-2微升色素標準溶液，掛于分別盛有a、b、c、d、e、f的展開劑的層析缸中，用上行法展開，待溶劑前沿展至15cm處，將濾紙取出于空氣中晾干，與標準斑比較定性。

    也可取0.5毫升樣液，在起始線上從左到右點成條狀，紙的右邊點色素標準溶液，依法展開，晾干后先定性后定量，靛藍在堿性條件下易褪色可用e展開劑。

    B、薄層色譜

    (1)薄層板的制備

    稱取1.6克聚胺粉，0.4克可溶性淀粉及2克硅膠G，置于合適的研缽中，加15毫升水研勻后，立即置涂布器中鋪成厚度為0.3mm的板。在室溫晾干后，于80℃干燥1小時置于燥器中備用。

(2)點樣

    離板底邊2cm處將0.5毫升樣液從左到右點成與底邊平行的條狀的右邊點2微升色素標準溶液。

    (3)展開

    莧菜紅與胭脂紅用d展開劑，靛藍與亮藍用e展開劑，檸檬黃與其他色素用f展開劑。取適量展開劑倒入展開槽中，將薄層板放入展開，待色素明顯分開后取出，晾干，與標準斑比較，如比移值相同即為同一色素。

    4、定量

A樣品測定   

將紙色譜的條狀色斑剪下，用少量熱水洗滌數次，洗液移入10毫升比色管中，并加水稀釋至刻度，作比色法定用。   

    將薄層色譜的條狀色斑包括有擴散的部分，分別用刮刀刮下，移入漏斗中，用乙醇-氨溶液解吸色素，少量反復多次至解吸液無色，收集解吸液于蒸發(fā)皿中，于水浴上揮發(fā)除去氨，移入10毫升比色管中，加水至刻度作比色用。

  B、標準曲線制備

分別吸取0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml胭脂紅，檸檬黃，日落黃色素標準使用液或0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml亮藍，靛藍色素標準溶液，分別置于10ml比色管中，各加水稀釋至刻度。

上述樣品與標準管分別用1cm比色杯，以零管調節(jié)零點，于一定波長下（胭脂紅510nm，莧菜紅520nm，檸檬黃430nm，日落黃482nm，亮藍627nm），測定吸光度，分別繪制標準曲線比較或與標準色列目測比較。

計算：

 X=(A*100)/(m*V2/V1*1000)

式中：

X：樣品中色素的含量，克/千克/升

A：測定用樣液中色素的含量，毫克

:m：樣品質量（體積），克（毫克）

V1：樣品解吸后總體積，毫升

V1：樣液點板（紙）體積，毫升