1. 準(zhǔn)備 NZY agar plates（至少用前 24 小時(shí)倒好） ，用前在37℃培養(yǎng)箱中烘烤1-2 小時(shí)以去除水滴。

2. 將過夜培養(yǎng)的 XL1-blueMRF' 細(xì)菌 2000 轉(zhuǎn)/ 分，離心10 分鐘，將細(xì)菌溶解在10mMMgSO4 中，調(diào)整細(xì)菌濃度為 OD600=0.5。

3. 融化 NZY top，并將 NZY top 放在 50℃水浴中。

4. 將適量的 XL1-blueMRF' 細(xì)菌溶液與一定稀釋度的 phage 文庫混合，37℃下共同作用 15 分鐘。

① 直徑 90mm 平板：200μl XL1-blue 細(xì)菌+適量的 phage文庫

② 直徑 150mm 平板：600μl XL1-blue 細(xì)菌+適量的 phag 文庫

（噬菌斑數(shù)量一般保持在 3000pfu/90mm;12000pfu/150mm）

5. 將步驟 4 中的混合液與 NZY top 溶液混合（200μl 混合液+3-4mlNZY top 溶液；600μl 混合液+8-10 ml NZY top 溶液） ，倒入到 NZYagar plates中，室溫 下放 10 分鐘左右，然后倒置放于 37℃下培養(yǎng)。

6. 當(dāng)噬菌斑剛好可看到時(shí)（大約 5-8 小時(shí)） ，從培養(yǎng)箱中拿出平板。

7. 將 NC 放入 10mMIPTG溶液中完全浸濕，在空中使膜瀝干，并做好 3 個(gè)不對稱的標(biāo)記。

8. 將 IPTG 處理好的 NC 貼在平板上，不留氣泡，然后倒置放于 37℃下培養(yǎng)。

9. 過夜培養(yǎng)后，第二天早上取出平板，用鑷子將膜輕輕掀起，注意不要將培養(yǎng)基粘在膜上。

10. 將膜放于 50mlTBST 溶液中，水平脫色搖床上震蕩洗膜 3 次，每次10 分鐘。

11. 將膜放入 50ml 封閉液中，水平搖動，封閉 4-6 小時(shí)。

12. 在封閉液中加入適當(dāng)?shù)味鹊囊豢�，水平搖動處理過夜。

13. 將膜放于 50mlTBST 溶液中，洗膜 3 次，每次 10 分鐘。

14. 在封閉液中加入適當(dāng)?shù)味鹊亩�抗（各個(gè)公司的二抗使用滴度不同），室溫水平搖動 1-2 小時(shí)。

15. 將膜放于 50mlTBST 溶液中，洗膜 3 次，每次10 分鐘，最后用 50mlTBS溶液洗膜 15-20 分鐘，取出膜空氣中瀝干。

16. 將膜放入 BCIP-NBT 顯色液中避光顯色，水平搖動直到陽性斑點(diǎn)可見為止。

17. 從顯色液中取出膜放在 TBS溶液中，空氣中使膜干燥。

18. 根據(jù)所做的標(biāo)記，將膜與平板對齊，將平板上對應(yīng)的陽性克隆區(qū)域的培養(yǎng)基挖出放入 500μl SM buffer中，并加入 25 ml chloroform，4℃貯存 （最多可貯6月）。

19. 第一輪篩選得到陽性克隆需要進(jìn)行第二輪篩選以去除假陽性并獲得陽性單克隆噬菌體。過程如第一輪篩選，只不過用直徑90mm 平板；具體過程見步驟 4， 這時(shí)所加入的噬菌體溶液是第一輪篩選得到的噬菌體上清 （見步18驟），

在用前要滴定好噬菌體的滴度，噬菌斑的數(shù)量以可區(qū)分出單個(gè)克隆，同時(shí)密 度不能太稀為標(biāo)準(zhǔn)（一般 100-200 pfu/90mm） 。

20. 按第一輪相似的過程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最后顯色，確定真正的陽性克隆，并將陽性單克隆所在的培養(yǎng)基挖出放入 500μl SM buffer 中，并加入 25 ml chloroform，4℃貯存（最多可貯存 6 月） 。

注意：

1. 封閉液一般可用：5%的脫脂牛奶或 1%的 BSA 溶解在 TBST溶液中。

2. 第一輪篩選用 150mm 的平板；第二輪篩選用 90mm 的平板，一般需要篩選 至少 1 x 106 pfu。

3. 認(rèn)真做好三個(gè)不對稱的標(biāo)記，特別在第二輪挑選陽性克隆時(shí)要仔細(xì)將膜與平 板吻合好，不能挑錯(cuò)。