Baiba Cabovska,¹Douglas M. Stevens,¹A. John Cunningham²  和Arthur E. Bailey²

¹沃特世公司(美國(guó)馬薩諸塞州米爾福德市)

²曼恩凱德生物醫(yī)療公司(美國(guó)康涅狄格州丹伯里市)

應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

有利于為諸如制藥、化工原料和食品工業(yè)等需要進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析工作的領(lǐng)域解決未知化合物鑒定所面臨的難題。提供一套鑒定可提取物的系統(tǒng)化工作流程。與QTof聯(lián)用的GC或UPLC均可采用同一工作流程。

沃特世解決方案

Xevo^® G2 QTof質(zhì)譜儀

大氣壓氣相色譜電離源(APGC)

MassLynx^®軟件

MS^E技術(shù)

MassFragment™軟件

關(guān)鍵詞

可提取物，浸出物，樹脂，單體和低聚物，增塑劑，穩(wěn)定劑，填充劑，著色劑，抗氧化劑，抗靜電劑，元素組成

簡(jiǎn)介

根據(jù)美國(guó)FDA要求，制藥行業(yè)需確保在預(yù)期產(chǎn)品保質(zhì)期內(nèi)藥品的包裝材料中不會(huì)有任何有毒或有害物質(zhì)遷移到藥品中^1-5。同樣，在食品和化妝品行業(yè)，人們對(duì)產(chǎn)品中存在的包裝材料浸出物的研究也非常關(guān)注。根據(jù)定義可知，可提取物是指在可控的提取條件下從包裝材料或設(shè)備組分中提取出的化合物。浸出物則是在正常保質(zhì)期內(nèi)從包裝材料遷移至產(chǎn)品中的化合物。在理想情況下，浸出物也可視作一種可提取物。如果一個(gè)公司無(wú)法對(duì)所有潛在污染物進(jìn)行全面準(zhǔn)確的鑒定，或是至少清楚了解化合物類別，那么很可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品召回、經(jīng)濟(jì)損失和/或品牌形象受損等嚴(yán)重后果⁶。

因此，我們開展了一項(xiàng)名為受控提取研究的初步調(diào)查，其中涉及某些類型的溶劑提取，如回流法、微波法或超臨界流體萃取法⁷。所選溶劑必須涵蓋較大的極性范圍，以確保非極性和極性分析物均能被提取。用于分析提取物的技術(shù)必須具有綜合性，可以適用于盡可能多的分析物，包括GC-FID-MS(揮發(fā)性物質(zhì))和LC-UV-MS(非揮發(fā)性物質(zhì))⁵。

在受控提取研究中，我們發(fā)現(xiàn)對(duì)于化合物來(lái)說(shuō)真正的挑戰(zhàn)就是對(duì)它的鑒定。很少有樹脂生產(chǎn)商能夠提供包裝材料聚合物中所使用的全部添加劑的完整清單。并且，原材料在生產(chǎn)過(guò)程中可能會(huì)降解或發(fā)生化學(xué)變化。此外，樹脂生產(chǎn)商可能并不了解化合物中可能存在的污染物。典型的可提取物包括由不完全聚合反應(yīng)生成的單體和低聚物；增塑劑、穩(wěn)定劑、填充劑、著色劑、抗氧化劑和抗靜電劑，以及它們的降解產(chǎn)物。除此之外，還有在模塑工藝后樹脂中殘留的洗滌劑和脫模劑.

實(shí)驗(yàn)
樣品制備

采用微波提取法制備樣品。將聚丙烯和尼龍樣品(2 g)用10 mL異丙醇在70 °C下提取3 h。提取完成后，將上清液轉(zhuǎn)移到GC樣品瓶中。

MS條件

MS系統(tǒng)：          Xevo G2 QTof與7890A GC

色譜柱：            HP1-MS，30 m x 0.32 mm，1.0微米膜

載氣：              He，2 mL/min

升溫程序：         35 °C下保持5 min，以20 °C/min升至320 °C，保持20.75 min

進(jìn)樣口：            300 °C

進(jìn)樣類型：         1 微升，不分流，1 min吹掃

輔助氣體：         N2，500 mL/min

掃描范圍：         50至1000 Da 

MS^E碰撞電壓：    15至25 eV

數(shù)據(jù)管理：         MassLynx 4.1版軟件

利用單四極桿GC/MS所獲得的一些分析物數(shù)據(jù)可通過(guò)市售譜庫(kù)(例如NIST)進(jìn)行確認(rèn)。但是，當(dāng)譜庫(kù)中未收錄目標(biāo)化合物或單四極桿MS靈敏度不足以進(jìn)行分析物陽(yáng)性鑒別時(shí)，揮發(fā)性物質(zhì)分析所面臨的難題就出現(xiàn)了。這時(shí)可以結(jié)合另一種技術(shù)，例如本應(yīng)用資料所介紹的大氣壓氣相色譜(APGC)和四極桿飛行時(shí)間(QTof)質(zhì)譜⁸。由于譜庫(kù)中沒(méi)有LC/MS數(shù)據(jù)，因此精確質(zhì)量數(shù)數(shù)據(jù)將十分有利于非揮發(fā)性物質(zhì)的分析。對(duì)于本文中所進(jìn)行的揮發(fā)性物質(zhì)和半揮發(fā)性物質(zhì)分析來(lái)說(shuō)，使用市售結(jié)構(gòu)解析工具在四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀中采集的MS^E數(shù)據(jù)已被證明在未知化合物的鑒定中具有重要意義。

工作流程

結(jié)果與討論

本研究采用了兩種廣泛使用的聚合物材料：聚丙烯和尼龍。在本應(yīng)用紀(jì)要中，對(duì)三類不同的可提取物進(jìn)行了鑒定：抗氧化劑、單體和單體降解產(chǎn)物。
 

如圖1所示，在聚丙烯樣品中，觀察到一個(gè)色譜峰(峰A)出現(xiàn)在保留時(shí)間26.3 min處。在精確質(zhì)量數(shù)APGC譜圖中進(jìn)行元素組成分析，如圖2所示，結(jié)果表明其分子式為C₄₃H₆₃O₃P，如圖3所示。元素組成軟件通過(guò)觀察到的質(zhì)量數(shù)計(jì)算可能的分子式，并使用同位素模型算法，將每個(gè)候選分子式所觀察到的模型與理論模型進(jìn)行匹配。在這種情況下，對(duì)于該離子有兩種選擇，如果僅考慮質(zhì)量數(shù)差異，則第二個(gè)更為接近。而結(jié)合質(zhì)量數(shù)差異和同位素匹配可得到一個(gè)最佳的正確結(jié)果。

在干燥模式的源條件下進(jìn)行APGC分析⁹，可以優(yōu)先于質(zhì)子化加合物([M+H]+)促進(jìn)分子離子(M.+)的形成。值得注意的是，在高能碰撞條件下，相比質(zhì)子化加合物，分子離子碎片更易產(chǎn)生；因此，在兩種通道中基峰存在顯著差異(646.4與647.4)，如圖2所示。

在ChemSpider中搜索建議的元素組成分子式，結(jié)果為Irgafos 168，如圖4所示，根據(jù)Little等人所述，按“# of References”(參考編號(hào))排序，該結(jié)果為最佳答案¹⁰。Irgafos 168是一種亞磷酸三芳基酯加工穩(wěn)定劑，可保護(hù)樹脂聚合物(如聚丙烯)，防止其在樹脂合成過(guò)程中發(fā)生氧化。

數(shù)個(gè)碎片與主要碎片離子Irgafos 168相匹配，從而增加了鑒定的可靠性，如圖5所示。MassFragment可識(shí)別母離子結(jié)構(gòu)中的化學(xué)鍵，并根據(jù)化學(xué)鍵斷裂的類型和可能性分配一個(gè)分值。另外，還會(huì)列出化學(xué)鍵斷裂的數(shù)目。分值越低(如，S:1.0，B:1.0與S:4.5，B:2.0)，產(chǎn)生該碎片結(jié)構(gòu)的可能性越大。

此工作流程的下一個(gè)步驟是購(gòu)買標(biāo)準(zhǔn)品，并與樣品的保留時(shí)間和碎片離子圖進(jìn)行比較。

眾所周知，月桂精內(nèi)酰胺是一種生產(chǎn)尼龍的原材料。在尼龍?zhí)崛∥镏�，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)月桂精內(nèi)酰胺單體(峰B)的保留時(shí)間為15.93 min，如圖6所示。按照先前示例所述的工作流程通過(guò)分子式和MassFragment報(bào)告確認(rèn)該峰。在保留時(shí)間16.07 min處觀察到一個(gè)較小的峰(峰C)。測(cè)得的質(zhì)量數(shù)與分子式C12H21NO相符，如圖7所示，這表明該峰可能是分子內(nèi)具有額外雙鍵的月桂精內(nèi)酰胺降解產(chǎn)物(月桂精內(nèi)酰胺單體為C₁₂H₂₃NO)。通過(guò)存在的內(nèi)源二聚體(2M+H)確認(rèn)各個(gè)譜圖中的母離子。對(duì)于月桂精內(nèi)酰胺，所觀察到的二聚體為m/z 395.3652，其降解產(chǎn)物的二聚體為m/z 391.3324。

使用ChemSpider搜索C₁₂H₂₃NO，結(jié)果顯示月桂精內(nèi)酰胺為第二最佳選擇。而搜索C₁₂H₂₁NO時(shí)，根據(jù)聚合物中的已知化合物未得到合適的匹配結(jié)果。

由于可能無(wú)法取得該降解產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)品，因此可以通過(guò)Xevo G2 QTof數(shù)據(jù)為此化合物指定一個(gè)結(jié)構(gòu)。我們無(wú)法確定月桂精內(nèi)酰胺環(huán)中雙鍵的確切位置。然而，在這類研究中，并不一定必須確定化合物的確切結(jié)構(gòu)，只需確定化合物的類別即可。顯而易見的是，該降解產(chǎn)物與月桂精內(nèi)酰胺相關(guān)，因此可以預(yù)計(jì)其毒理學(xué)特性與月桂精內(nèi)酰胺相似。

結(jié)論

♦Xevo G2 QTof是一種用于可提取物的鑒定和結(jié)構(gòu)解析的重要工具。利用MS^E功能，可以同時(shí)采集母離子和碎片離子信息。精確質(zhì)量數(shù)和碎片信息有助于確定許多未知化合物的結(jié)構(gòu)。

♦當(dāng)市售譜庫(kù)中未提供目標(biāo)化合物的信息時(shí)，元素組成和Mass Fragment軟件可以提供與分析物相關(guān)的額外信息。

♦本文所述的工作流程有利于為諸如制藥、化工原料和食品工業(yè)等需要進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析工作的領(lǐng)域解決未知化合物鑒定所面臨的難題。

♦通常，根據(jù)已知存在的組分并結(jié)合碎片、最可能的分子式和一些化學(xué)常識(shí)，便能夠獲得可能的化合物結(jié)構(gòu)。在可提取物的研究中，如果目標(biāo)是建立安全性閾值，那么一個(gè)可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)通常就能提供充分的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

1.  M P Balogh. “Testing the Critical Interface: Leachables and Extractables”. 

LCGC, June 1, 2011.

2.  F Mofatt. Extractables and Leachables in Pharma-Serious Issue.   

http://www.solvias.com/sites/default/files/solvias_whitepaper_web.pdf

3.  Containers Closure Systems for Packaging Human Drugs and Biologics; 

Guidance for Industry. U.S. Department of Health and Human Services Food 

and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) and 

Center for Biologics Evaluation and Research (CBER), Rockville, MD. May 1999.

4.  D L Norwood, Q Fenge. Strategies for the analysis of pharmaceutical excipients 

and their trace level impurities. Am Pharm Rev. 7(5): 92, 94, 96-99, 2004.

5.  Safety Thresholds and Best Practices for Extractables and Leachables in Orally 

Inhaled and Nasal Drug Products, Leachables and Extractables Working Group. 

Product Quality Research Institute (PQRI), 2006. (WWW.PQRI.ORG).

6.  http://www.webmd.com/pain-management/news/20110629/

new-tylenol-recall-due-to-musty-odor

7.  M Ariasa, I Penichet, F Ysambertt, R Bauza, M Zougaghc, Á Ríos. Fast 

supercritical fluid extraction of low- and high-density polyethylene additives: 

Comparison with conventional reflux and automatic Soxhlet extraction.  

J. of Supercritical Fluids, 50: 22-28, 2009.

8.  Detection and Identification of Extractable Compounds from Polymers.  

Waters Technology Brief, no. 720004211en, January, 2012. 

9.  Determination of High Molecular Weight Phthalates in Sediments Using 

Atmospheric Pressure Chemical Ionization GC/MS. Waters poster,  

no. PSTR134667160.

10. J L Little, A J Williams, A Pshenichnov, V Tkachenko. Identification of “known 

unknowns” utilizing accurate mass data and ChemSpider. JASMS. 23(1): 

179-185, 2012.