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分子克隆常用載體

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-04-26

 

  DNA片段的克隆需要合適的載體,載體或是質(zhì)粒,或是噬菌體,或是病毒,通常大多經(jīng)過人工改造[地的。作為載體必須具備兩條件:一是該載體在細(xì)胞內(nèi)必須能自主復(fù)制,即必須具備復(fù)制原點(diǎn);二是該載體必須具備適合的酶切位點(diǎn),且這些酶切位點(diǎn)不在復(fù)制原點(diǎn)區(qū)域內(nèi)。以上兩條,保證了載體的可繁殖性和可利用性。為了便于獲得陽隆克隆,載體上常有篩選標(biāo)記,如對抗菌素的抗性,某些基因產(chǎn)物的顯色反應(yīng)等。

一、質(zhì)粒
常用的有pBR322,pUC系列質(zhì)粒等。
(一)pBR322質(zhì)粒是4362bp的環(huán)狀雙鏈DNA載體,有2個(gè)抗藥性基因(四環(huán)素和氨芐青霉素),一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)和多個(gè)用于克隆的限制酶切點(diǎn)。當(dāng)缺失抗藥性基因的大腸桿菌被pBR322成功地轉(zhuǎn)化時(shí),它便從該質(zhì)粒獲得了抗生素抗性。兩個(gè)抗生素基因中均含供插入外源DNA用的不同的單一酶切位點(diǎn)。一般只選一個(gè)抗生素基因作為插入外源DNA之用。外源DNA插入后該抗生素抗性失活。另一抗生素抗性基因則作為轉(zhuǎn)化細(xì)菌后篩選陽性克隆之用。

(二)pUC系列質(zhì)粒是2.7Kb的雙鏈DNA質(zhì)粒,有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn),一個(gè)氨芐青霉素抗性基因和一個(gè)多克隆位點(diǎn),多克隆位點(diǎn)處于表達(dá)LacZ基因產(chǎn)物-β-半乳糖苷酶的氨基端片段,用pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化LacZ基因有突變的大腸桿菌株(M15)時(shí),因?yàn)橛少|(zhì)粒表達(dá)的α-肽補(bǔ)充了大腸桿菌卻失的α-肽,所以恢復(fù)了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和X-gal的培養(yǎng)基上,長出藍(lán)色克隆。如果在多克隆位點(diǎn)內(nèi)插入外源DNA,由于它破壞了α-肽的表達(dá),因而在加入IPTG和X-gal的培養(yǎng)基,不能長出藍(lán)色克隆,這就是所謂的藍(lán)白篩選。

 二、單鏈絲狀噬菌體和噬粒

(一)大腸桿菌絲狀噬菌體包括M13噬菌體f噬菌體等,其基因組均是單鏈閉環(huán)DNA分子,其中M13mp系列克隆載體是對野生型M13加以改造,插入了多克隆位點(diǎn)和LacZ基因后的載體,所以也是可以利用IPTG和X-gal作藍(lán)白篩選的,M13感染大腸桿菌后,即在菌體內(nèi)酶的作用下,以感染性單鏈DNA(正鏈)為模板,轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA,稱作復(fù)制型DNA(RF DNA)。一般當(dāng)每一個(gè)細(xì)胞內(nèi)有100-200個(gè)RF DNA拷貝時(shí),即停止復(fù)制,產(chǎn)生有感染性的完整的單鏈絲狀噬菌體并分泌離開菌體。感染M13的大腸桿菌可繼續(xù)生長,并不發(fā)生裂解,但生長速度則較正常菌慢,取感染M13的細(xì)菌培養(yǎng)液離心,即可從菌體中提取RF DNA,供限制酶切割等分子克隆操作之用;從離心后的上清液中,可用聚乙二醇(PEG)沉出噬菌體顆粒,提取單鏈DNA(ss DNA)供DNA序列分析,體外定位突變等使用。

(二)噬粒(phagemid)在質(zhì)粒DNA中插入一段單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起始點(diǎn)DNA,即構(gòu)成了噬粒,如pGEM-3Zf(-)就是一種噬粒。噬?上褚话阗|(zhì)粒一樣操作,但當(dāng)需要制備單鏈DNA時(shí),就需要在培養(yǎng)時(shí)加入輔助噬菌體,常用的輔助噬菌體有M13KO7和R408。培養(yǎng)好的菌液在離心除去菌體后,上清中加入PEG即可沉出含有單鏈DNA的顆粒。噬粒也常用于DNA序列分析和體外定位突變。分子克隆常用載體除了上述兩類以外,還有 噬菌體和粘粒,詳細(xì)情況可參閱有關(guān)資料。

 

 
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