眾所周知，在反相液相色譜中，固定相是非極性的，而流動相是極性的。我們如何使流動相呈極性呢？通過添加水這樣的水性組分。然而，添加水的比例有限制，不能使用含水量過高的流動相進行反相液相色譜分析，如90%、95%甚至100%。那么，這是什么原因呢？

首先，我們需要了解為什么要使用高含水量的流動相。原因可能是為了保留高極性分子，如有機酸。例如抗壞血酸，這些分子在性質上是高極性的，它們在反相液相色譜中不會被充分保留，因為我們的固定相是非極性的，而非極性固定相不會保留這些極性化合物。因此，需要在流動相中添加高比例的水相。這是因為水是一種極性溶劑，它能夠與極性較強的分析物形成氫鍵或離子相互作用，從而降低分析物在流動相中的溶解度，有利于分析物在色譜柱上的保留和分離。

接下來，我們需要了解C8或C18固定相的性質。C8/C18是一種常用的反相液相色譜柱，其表面鍵合有C8或C18烷基鏈，具有類似油脂的非極性特性。在反相色譜法中，分析物在流動相和固定相之間進行分配，以實現(xiàn)分離。由于C8/C18柱的固定相非極性，它們通常適用于分析非極性或弱極性分析物。然而，油水不能混合，類似油脂的非極性特性使得C8或C18固定相在高比例水相中不能被潤濕。當流動相中有一定比例的有機溶劑，如乙腈或甲醇（其性質為非極性）時，對C8或C18具有良好的潤濕性。而鍵合的固定相是位于硅膠孔內的，這意味流動相能夠潤濕C8或C18固定相的孔。這一點是非常重要的，否則它們將無法實現(xiàn)對目標分析物的保留。然而，如果使用100%的水相作為流動相，這會使C8或C18鍵合固定相干涸。因為水具有較高的表面張力，流經固定相的水分子不會進入孔內，而只會通過孔之間的空間。這樣一來，孔就不會打開，如果孔沒有被潤濕，那么固定相無法處于活躍狀態(tài)，不能與分析物發(fā)生相互作用。這就是在反相液相色譜中使用C8/C18柱時要避免高水相流動相的原因。

當C8/C18固定相暴露在高水相流動相中時，由于表面張力較高，C8/C18表面會脫水，這種現(xiàn)象稱為固定相塌陷、鏈折疊或固定相打結，化合物無法正常地與固定相發(fā)生相互作用進行保留。

那么，固定相塌陷會帶來哪些問題呢？固定相塌陷可能會導致保留減少、保留時間的不重復的現(xiàn)象。并且如果想再次從干涸狀態(tài)恢復到潤濕狀態(tài)，這個反向過程將需要很長的時間。保留的減少是因為鍵合固定相的活性表面存在于硅膠孔中，而孔內沒有被潤濕，化合物也無法進入孔內與其發(fā)生相互作用。因此，保留時間會減少。例如，如果使用90%的水和10%的甲醇作為流動相，保留時間為10分鐘。此時，如果只使用100%的水，10分鐘的保留時間會急劇減少到3~4分鐘。第二個重要的點是保留時間的重復性會降低，可能會隨著時間的推移而發(fā)生變化。所以，如果保留時間變化很大，可能是因為流動相中水含量較高。

如果別無選擇，只能使用水性或高比例水相的流動相，那么在方法開發(fā)階段，需要注意選擇合適的色譜柱。

1.未封端色譜柱。未封端柱表面存在較多的具有一定極性的游離硅醇，游離硅醇使固定相表面能被潤濕，有利于極性分析物的保留。

2.短鏈烷基色譜柱：鍵合鏈之間存在游離體積，硅醇的屏蔽作用很小，有利于極性分析物的分離。

3.極性嵌入烷基相色譜柱：在烷基鏈中嵌入極性基團，增強與極性分析物之間的相互作用，提高保留性能。

4.寬孔徑相色譜柱：以便水可以滲透到孔內使相濕潤，有利于極性分析物在高水相流動相下的保留。

綜上所述，在使用C8/C18色譜柱時，應避免高水相流動相，以免造成固定相塌陷等問題。針對高水相流動相下保留極性分析物的需求，可以選擇其他類型的色譜柱進行分析。