不同的細菌，或者由于觀察者所側(cè)重觀察的內(nèi)容不同一，所以所使用的染料也有差異，但是簡單染色的方法是一樣的。先按照上述的制片方法制片，制成需要觀察的玻片后，使用相對應(yīng)的染料滴加到玻片上菌膜區(qū)域，以覆蓋菌膜為準。按照不同染料的要求，結(jié)合所觀察的內(nèi)容確定染色時間，染色時間到達時，進行水洗，干燥等步驟(見圖5-2)。最后得到的玻片加蓋蓋玻片即可進行鏡檢。如有需要可以后續(xù)再進行油封、蠟封等封片過程。

二、芽孢染色法

芽孢桿菌屬和梭狀芽孢桿菌屬的細菌能產(chǎn)生內(nèi)孢子，這些孢子耐高溫、干旱及有毒化學試劑。內(nèi)孢子還能抵制細菌染色液的進入，在革蘭氏染色法涂片染色時，革蘭氏陽性菌的芽孢呈現(xiàn)無色。然而，芽孢一旦著色后就很難脫色。

雖然芽孢通�？稍诟锾m氏染色片中看到(芽孢由于不易讓染料進入多呈現(xiàn)無色),但在不易清晰觀察時，可用特殊的芽孢染色法，使芽孢與菌體呈現(xiàn)不同顏色，更便于觀察。其實驗的操作方法與革蘭氏染色類似。主要的芽孢染色法有以下兩種。

(一)孔雀綠染色法

(1)將生有芽孢的斜而菌苔按革蘭氏染色法涂片后，用飽和孔雀綠水溶液(約為

7.6%)染10 min。

(2)用自來水沖洗。

(3)用0.5%番紅液復(fù)染30%.

(4)水洗，吸干。

(5)鏡檢：芽孢呈綠色，菌體和芽抱囊呈微紅色，但應(yīng)注意菌體中有異染粒時，也可呈綠色。

(二) 石炭酸復(fù)紅染色法

(1)按常規(guī)涂片。

(2)滴加石炭酸復(fù)紅于涂片上，并于玻片下緩緩加熱，使染液冒蒸氣但不沸騰，并繼續(xù)滴加染液，不使涂片上染液蒸干，這樣保持5 min。

(3)涂片冷卻后，傾去染液，用酸性乙醇脫色至無紅色染劑洗脫為止。

(4)徹底水洗。

(5)用呂氏美藍復(fù)染2 min -3 min。 

(6)水洗、吸干。

(7)鏡檢：鏡檢時，菌體及孢囊呈藍色，芽孢呈紅色。

具體實驗時，在對一些特殊芽孢染色時，需要對染色液和復(fù)染液進行修改。

三、鞭毛染色

鞭毛是細菌的運動器官，非常纖細，直徑一般為10nm~20 nm,超出了光學顯微鏡的觀察極限，因此通常情況下在顯微鏡下觀察不到鞭毛。通過使用特殊的染色技術(shù)，可以將染色液附加到鞭毛的周圍，增加它的直徑，從而能夠在光學顯微鏡下觀察到鞭毛，而且能檢測鞭毛在細菌中的分布。尤其是鞭毛染色可用于區(qū)分假單胞菌科的一些有兩極鞭毛的細菌和腸桿菌科有周身鞭毛的細菌(在運動時)。

鞭毛十分細小，很容易從細菌上脫離，所以要得到非常滿意的鞭毛染色玻片十分困難。另外，很多染色方法會產(chǎn)生沉淀物，這又使得觀察鞭毛十分困難。

鞭毛染色一般分為兩類：一種是銀鹽法，使銀在鞭毛上堆積；另一種是使用復(fù)紅沉積在鞭毛上。

(一)銀鹽沉積法(改進的Fontana方法)

應(yīng)使用絕對干凈(無油脂)的載玻片進行染色，最好是新的無油載玻片。用過的載玻片要在酪酸洗液中浸泡，并用蒸餾水沖洗干凈后方可再次使用。

細菌在瓊脂斜面上，比最佳生長溫度低3℃~5℃的溫度下培養(yǎng)，可在斜面上加1滴~2滴滅菌的生理鹽水保持濕度。

(1)將載玻片在火焰上快速灼燒5s,放在染色架上冷卻，用蠟筆分成兩個區(qū)域(用鑷子夾住載玻片的一端)。

(2)用移液管或巴斯德移液管移取2mL無菌水加入到幼齡(通常為18 h)、生長活躍的斜面菌株中，慢慢振蕩并旋轉(zhuǎn)試管使菌株懸浮。建議盡量避免使用接種環(huán)。然后轉(zhuǎn)移到干凈的試管中，通過懸滴試驗檢查菌體的運動性。用無菌水將懸浮液稀釋至略有渾濁為止。放入20 ℃ -30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min,然后移取一滿環(huán)懸浮液加在已冷卻的載玻片一端。傾斜載玻片讓液滴流到蠟筆畫的中心線。在空氣中自然干燥，不要加熱玻片。

(3)用媒染色劑媒染5 min。

(4)慢慢用蒸餾水充分漂洗掉所有的媒染液。

(5)用熱的Fontana銀液覆蓋，染色5 min,每隔1 min更換1次染色液( Fontana銀液在沸水浴中加熱)。細菌涂層的每一部分都始終要浸在染色液中，不能裸露。

(6)用水沖洗，在空氣中晾干，鏡檢。

(二) Leifson替代染色法

下述Leifson鞭毛染色法可以代替上述方法的(3) ~(6)。

(1)滴加1 ml的Leifson鞭毛染色液，注意不要使染色液干燥，直到玻片上形成細微的鐵銹色沉淀(約10 min) 。

(2)慢慢地用蒸餾水充分沖洗干凈。

(3)用1%的亞甲基藍復(fù)染5 min ~10 min。

(4)用水洗凈，空氣中干燥，鏡檢。沒有復(fù)染時，細胞和鞭毛都呈現(xiàn)桃紅色，復(fù)染后，細胞染成藍色，鞭毛染成紅色。

實驗中需要注意的是鞭毛很容易脫落，若觀察時視野中大多為周身鞭毛細胞，說明該菌是周毛菌，但若觀察到一個明顯的極端鞭毛細胞時，并不一定說明不是周毛菌。

注意事項：

(1)適宜的培養(yǎng)基、溫度和通氣條件下，以短期內(nèi)多次連續(xù)接種培養(yǎng)的幼齡菌種鞭毛情況最好。因此，用于鞭毛染色的菌種常常用幼齡菌，菌齡老化或某些培養(yǎng)條件變化常導致鞭毛脫落或喪失。

(2)玻片應(yīng)清潔無油污。鞭毛非常纖細且容易脫落，故操作過程動作要輕。

(3)染色法的染料須當日配制， 4 h內(nèi)效果最好。所以鞭毛染色液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。

四、莢膜染色

莢膜是某些細菌在新陳代謝過程中形成的，分泌于細胞壁外的一層膠狀黏液性物質(zhì)，主要化學成分是多糖類物質(zhì)。莢膜的折光性低，易溶于水，與染料親和力低，但莢膜的通透性比較好，某些染料可透過莢膜而使菌體著色。因此染色后在菌體周圍有一淺色或無色的透明圈，即為莢膜。一般采用負染色的方法，使背景與菌體之間形成一透明區(qū)，將菌體襯托出來便于觀察分辨，故又稱襯托法染色。因莢膜薄，且易變形，所以不能用加熱法固定。

具體操作步驟(見圖5-8)。

(一)制片

加1滴6%葡萄糖水溶液于載玻片一端，無菌操作，挑取細菌斜面上培養(yǎng)72 h左右的膠質(zhì)芽孢桿菌與其混合。

(二)推片法制片

加1滴墨汁充分混勻。用推片法制片，將菌液鋪成薄層， 自然干燥。

(三)固定

滴加1滴~2滴無水乙醇覆蓋涂片，固定1 min, 自然干燥；也可以不加處理， 自然干燥。

注意：不能用火加熱干燥。

(四)結(jié)晶紫染色

在已自然晾干的涂面上，滴加1%結(jié)晶紫染色液染色。

(五)沖洗

2 min后，以20%硫酸銅沖洗數(shù)次。再用自來水沖洗1次。

(六)拭干水分后鏡檢

用擦鏡紙拭干水分后鏡檢。有莢膜的菌菌體呈紫色，背景灰黑色，莢膜不著色呈無色透明圈。無莢膜的菌，由于干燥菌體收縮，菌體四周也可能出現(xiàn)一圈狹窄的不著色環(huán)，但這不是莢膜，莢膜不著色的部分寬。

五、死活染色

在顯微鏡下活細胞細胞膜完整、立體感強，細胞質(zhì)透明度好，顆粒狀物質(zhì)少；死細胞膜破裂，無立體感，細胞通透性差，有顆粒狀物質(zhì)、空泡。

染色排除法是生物研究中判斷細胞活性的一種常用方法，簡便，易于操作，實驗是利用了死活細胞在生理機能和性質(zhì)上的差異來進行的。原理：因為活細胞的細胞膜具有選擇透過性，細胞不需要的物質(zhì)通常不進入細胞，染色劑中如臺盼藍能進入死細胞，從而可以使死細胞染色。依此染色便可以判斷細胞的活性。

活細胞必須要通過控制物質(zhì)進出細胞膜來保持內(nèi)部生理環(huán)境的穩(wěn)定性。細胞死后，細胞膜通透性發(fā)生改變，原先不能進入細胞的物質(zhì)也能夠進入細胞。常見的細胞染料有：中性紅、臺盼藍、甲基藍、美藍、熒光素雙乙酸酯等。臺盼藍染料正常情況下被活細胞攔在細胞膜外，只有細胞膜受損或者細胞死亡后，才能進入細胞，從而與解體的DNA結(jié)合，使其著色，因此，活細胞一般不被臺盼藍染色，而死細胞會被染成藍色。通過顯微鏡觀察很容易識別出死亡的染色細胞，并可用細胞計數(shù)板進行計數(shù)。

用美藍染色液可以對酵母菌細胞進行死活染色鑒別。美藍是一種弱氧化劑，氧化態(tài)呈藍色，還原態(tài)呈無色�；畹慕湍敢驗樾玛惔�謝不斷進行，具有一定的還原能力，能將進入細胞的美藍還原，而細胞不染色。因此，用美藍對酵母細胞染色一定時間后，無色的為活細胞，藍色的為死細胞。需要注意的是：一個活細胞的還原能力是有限的，必須嚴格控制染色的時間和染料的濃度。

方法：取0.1%美藍液一滴，滴在玻片中央，加一滴酵母菌懸液，混勻。染色3 min ~5 min后，加蓋片制成水浸標本片，即可鏡檢，這種方法也適用于細菌和霉菌。