單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎和單核細(xì)胞增多。它廣泛存在于自然界中，食品中存在的單增李氏菌對(duì)人類的安全具有危險(xiǎn)，該菌在4℃的環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，因此，在食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)中，必須加以重視。

一、生物學(xué)特性

1、形態(tài)與染色

　　該菌為革蘭氏陽(yáng)性短桿菌，大小約為0.5μmх1.0-2.0μm,直或稍彎，兩端鈍圓，常呈V字型排列，偶有球狀、雙球狀，兼性厭氧、無(wú)芽胞，一般不形成莢膜，但在營(yíng)養(yǎng)豐富的環(huán)境中可形成莢膜，在陳舊培養(yǎng)中的菌體可呈絲狀及革蘭氏陰性，該菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脫落。

2、培養(yǎng)特性

　　該菌營(yíng)養(yǎng)要求不高，在20--25℃培養(yǎng)有動(dòng)力，穿刺培養(yǎng)2�5天可見倒立傘狀生長(zhǎng)，肉湯培養(yǎng)物在顯微鏡下可見翻跟斗運(yùn)動(dòng)。該菌的生長(zhǎng)范圍為2--42℃（也有報(bào)道在0℃能緩慢生長(zhǎng)），最適培養(yǎng)溫度為35--37℃，在pH中性至弱堿性（pH9.6）、氧分壓略低、二氧化碳張力略高的條件下該菌生長(zhǎng)良好，在pH3.8�4.4能緩慢生長(zhǎng)，在6.5% NaCl 肉湯中生長(zhǎng)良好。在固體培養(yǎng)基上，菌落初始很小，透明，邊緣整齊，呈露滴狀，但隨著菌落的增大，變得不透明。在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺種血平板培養(yǎng)后可產(chǎn)生窄小的β-溶血環(huán)。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆瓊脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)瓊脂上，用45⁰角入射光照射菌落，通過解剖鏡垂直觀察，菌落呈蘭色、灰色或蘭灰色。

3、生化反應(yīng)

　　該菌觸酶陽(yáng)性，氧化酶陰性，能發(fā)酵多種糖類，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，如發(fā)酵葡萄糖、乳糖、水楊素、麥芽糖、鼠李糖、七葉苷、蔗糖（遲發(fā)酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不發(fā)酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、側(cè)金盞花醇、棉子糖、衛(wèi)矛醇和纖維二糖，不利用枸櫞酸鹽，40%膽汁不溶解，吲哚、硫化氫、尿素、明膠液化、硝酸鹽還原、賴氨酸、鳥氨酸均陰性，VP、甲基紅試驗(yàn)和精氨酸水解陽(yáng)性。

4、血清型

　　根據(jù)菌體（O）抗原和鞭毛(H)抗原，將單增李氏菌分成13個(gè)血清型，分別是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e 和“7”13 個(gè)血清型。致病菌株的血清型一般為1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b,后兩型尤多。

5、抵抗力

　　該菌對(duì)理化因素抵抗力較強(qiáng)，在土壤、糞便、青儲(chǔ)飼料和干草內(nèi)能長(zhǎng)期存活，對(duì)堿和鹽抵抗力強(qiáng)，60-70℃經(jīng)5-20min可殺死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氫氧化鈉、2.5%福爾馬林20min 可殺死此菌。該菌對(duì)青霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素、磺胺均敏感。

二、流行病學(xué)

　　單增李斯特氏菌廣泛存在于自然界中，不易被凍融，能耐受較高的滲透壓，在土壤、地表水、污水、廢水、植物、青儲(chǔ)飼料、爛菜中均有該菌存在，所以動(dòng)物很容易食入該菌，并通過口腔-糞便的途徑進(jìn)行傳播。據(jù)報(bào)道，健康人糞便中單增李氏菌的攜帶率為0.6-16%,有70%的人可短期帶菌，4-8%的水產(chǎn)品、5-10%的奶及其產(chǎn)品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被該菌污染。人主要通過食入軟奶酪、未充分加熱的雞肉、未再次加熱的熱狗、鮮牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西紅柿、法式餡餅、凍豬舌等而感染，約占85-90%的病例是由被污染的食品引起的。

　　該菌可通過眼及破損皮膚、粘膜進(jìn)入體內(nèi)而造成感染，孕婦感染后通過胎盤或產(chǎn)道感染胎兒或新生兒,棲居于陰道、子宮頸的該菌也引起感染，性接觸也是本病傳播的可能途徑，且有上升趨勢(shì)。

三、致病性

　　單增李氏菌進(jìn)入人體后是否發(fā)病，與菌的毒力和宿主的年齡、免疫狀態(tài)有關(guān)，因?yàn)樵摼�是一種細(xì)胞內(nèi)寄生菌，宿主對(duì)它的清除主要靠細(xì)胞免疫功能。因此，易感者為新生兒、孕婦及40歲以上的成人，此外，酗酒者、免疫系統(tǒng)損傷或缺陷者、接受免疫抑制劑和皮質(zhì)激素治療的患者及器官移植者也易被該菌感染。該病的臨床表現(xiàn)，健康成人個(gè)體出現(xiàn)輕微類似流感癥狀，新生兒、孕婦、免疫缺陷患者表現(xiàn)為呼吸急促、嘔吐、出血性皮疹、化膿性結(jié)膜炎、發(fā)熱、抽搐、昏迷、自然流產(chǎn)、腦膜炎、敗血癥直至死亡。

　　單增李氏菌的抗原結(jié)構(gòu)與毒力無(wú)關(guān)，它的致病性與毒力機(jī)理如下：

1、寄生物介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)增生，使它附著及進(jìn)入腸細(xì)胞與巨噬細(xì)胞；

2、抗活化的巨噬細(xì)胞，單增李氏菌有細(xì)菌性過氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬細(xì)胞內(nèi)的過氧物（為殺菌的毒性游離基團(tuán)）分解；

3、溶血素，即李氏桿菌素O，可以從培養(yǎng)物上清液中獲得，為SH�活化的細(xì)胞溶素，有α和β兩種，為毒力因子。

四、檢驗(yàn)和控制

（一）檢驗(yàn)

1、增菌培養(yǎng)

　　取回的樣品應(yīng)在4℃下處理、存放和運(yùn)送，如果是冷凍樣品，則在檢驗(yàn)前要保持冷凍狀態(tài)。

　　取25mL液體或25g半固體或固體樣品放入含有225mL無(wú)選擇性試劑增菌肉湯（EB）的均質(zhì)杯中進(jìn)行均質(zhì)，然后轉(zhuǎn)入三角瓶中，30℃培養(yǎng)4h，加入選擇性試劑吖啶黃素、萘啶酮酸和放線菌酮，繼續(xù)培養(yǎng)20h和44h.。

2、分離

　　共培養(yǎng)24h和48h后，取EB培養(yǎng)物分別在OXA和LPM或加七葉苷/Fe3+LPM瓊脂平板上劃線。PALCAM瓊脂可替代LPM瓊脂。將OXA和PALCAM平板置于35℃培養(yǎng)24-48h，LPM平板在30℃培養(yǎng)24-48h。然后，把LPM平板放于解剖鏡載物臺(tái)上，以45⁰角入射光從平板下面照射平板，通過目鏡垂直向下觀察尋找可疑菌落。李斯特氏菌在LPM平板上呈有光澤的蘭色或灰色。用已知陽(yáng)性菌和陰性菌劃線的平板作對(duì)照。

　　加入七葉苷和Fe3+的LPM平板不用斜射光系統(tǒng)，選擇可疑菌落的方法與在OXA上選擇可疑菌落的方法相同。在OXA平板上李斯特氏菌菌落周圍有一個(gè)黑色環(huán)，其它菌也可形成黑色環(huán)，但形成時(shí)間要在兩天以上。李斯特氏菌在PALCAM和OXA平板上的菌落特征相似。

　　在PALCAM和OXA或LPM平板上挑取5個(gè)或更多的典型菌落，分別劃線于TSAYE平板上以得到更純、更典型的單個(gè)菌落。食品檢驗(yàn)中在TSAYE平板上純化是必須的，因?yàn)樵赑ALCAM和OXA或LPM平板上分離菌落時(shí)可能沾有不可見的受抑微生物。挑取5個(gè)典型菌落的原因是一個(gè)樣品中可能分離到一種以上的李斯特氏菌。30℃TSAYE平板培養(yǎng)24-48h，如果不用于動(dòng)力觀察，也可在35℃培養(yǎng)。

3、鑒定步驟

　�。�1）觀察TSAYE平板通過斜射光觀察，尋找呈蘭灰至蘭色菌落。在TSAYE上用已知菌作對(duì)照。

　�。�2）、從30℃或更低溫度下培養(yǎng)的TSAYE平板上挑取典型菌落做成濕玻片在油鏡下觀察。濕玻片用0.85%生理鹽水菌懸液制成。如果菌量太少，菌體黏附于載玻片上而呈現(xiàn)非運(yùn)動(dòng)性。李斯特氏菌是細(xì)短桿菌，可見輕微的旋轉(zhuǎn)及翻滾。與已知的李斯特氏菌的對(duì)照相比，球形、大的桿狀且快速泳動(dòng)的都不是李斯特氏菌。

　�。�3）挑取典型菌落進(jìn)行過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)，李斯特氏菌呈過氧化氫酶陽(yáng)性反應(yīng)。

　�。�4）取16-24h的培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色，李斯特氏菌呈革蘭氏陽(yáng)性桿菌。但是陳舊培養(yǎng)物革蘭氏染色會(huì)發(fā)生變化，而且菌體可成球形。在染色過重的玻片上菌體有呈柵狀排列的趨勢(shì)，易誤認(rèn)為白喉菌而錯(cuò)判。

　�。�5）挑取典型菌落接種于TSBYE肉湯管中，35℃培養(yǎng)24h用做糖類發(fā)酵和其它生化項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)。TSBYE肉湯管在4℃下可存放幾天，也可反復(fù)接種。

　�。�6）在TSAYE平板上挑取典型菌落刺種到5%的綿羊血或馬血瓊脂平板上，刺種時(shí)避免觸到平板底部和使瓊脂破裂，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照（單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和綿羊李斯特氏菌）和陰性對(duì)照（英諾克李斯特氏菌），35℃培養(yǎng)48h。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌呈窄小的β-溶血環(huán)。

　　（7）在明亮的光照下，觀察經(jīng)穿刺的血瓊脂平板，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和西爾李斯特氏菌圍繞穿刺點(diǎn)產(chǎn)生較清晰的β-溶血環(huán)，英諾克李斯特氏菌不產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，而綿羊李斯特氏菌產(chǎn)生界限明顯的較大溶血環(huán)，在此不要試圖進(jìn)行種間的區(qū)分，但要記錄下溶血反應(yīng)的特征，CAMP試驗(yàn)可區(qū)分它們間的溶血反應(yīng)。

　�。�8）硝酸鹽還原試驗(yàn)（選做）。用TSBYE肉湯培養(yǎng)物接種于硝酸鹽肉湯中，35℃培養(yǎng)5天后，加入0.2mL試劑A，再加入0.2mL試劑B，混合，出現(xiàn)紫紅色為陽(yáng)性反應(yīng)，表明硝酸鹽已被還原，如無(wú)顏色出現(xiàn)，在試管內(nèi)再加入少量鋅粉，放置1h，如出現(xiàn)紫紅色，表明硝酸鹽仍存在，未被細(xì)菌還原。只有默氏李斯特氏菌還原硝酸鹽，因此，從格氏李斯特氏菌中區(qū)分出默氏李斯特氏菌就必須進(jìn)行這唯一的試驗(yàn)。本試驗(yàn)還有一等效試驗(yàn)，即加入0.2mL試劑A后，再加入0.2mL試劑C，出現(xiàn)橙色表明硝酸鹽已被還原。如未出現(xiàn)顏色反應(yīng)，也加入少量鋅粉，若出現(xiàn)橙色表明硝酸鹽未被還原。

　�。�9）將TSBYE培養(yǎng)物穿刺到SIM和MTM試管中，室溫培養(yǎng)7天，每日觀察，李斯特氏菌呈典型傘狀生長(zhǎng)。在MTM中傘狀生長(zhǎng)更典型。同時(shí)，30℃的TSBYE培養(yǎng)物在油鏡下可見細(xì)菌作翻轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。

　　（10）將TSAYE肉湯培養(yǎng)物分別接種于0.5%（W/V）葡萄糖、麥芽糖、七葉苷、甘露醇、鼠李糖、木糖發(fā)酵管內(nèi)（可選用倒立發(fā)酵管），35℃培養(yǎng)7天，呈陽(yáng)性反應(yīng)的李斯特氏菌產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，李斯特氏菌發(fā)酵鼠李糖和木糖的情況見下表。所有李斯特氏菌對(duì)葡萄糖、七葉苷、麥芽糖均能發(fā)酵，除格氏李斯特氏菌均不能發(fā)酵甘露醇。如果在OXA、PALCAM或加七葉苷/Fe3+的LPM分離平板上菌落色素很明顯，則七葉苷試驗(yàn)可免做。

李斯特氏菌屬的區(qū)別

 

種別	溶血	硝酸鹽	糖發(fā)酵
			甘露醇	鼠李糖	木糖
單增李斯特氏菌	+	-	-	+	-
英諾克李斯特氏菌	-	-	-	V	-
威爾斯李斯特氏菌	-	-	-	V	+
西爾李斯特氏菌	+	-	-	-	+
格氏李斯特氏菌	-	-	+	V	-
綿羊李斯特氏菌	+	-	-	-	+

 

V:反應(yīng)不定

4、血清學(xué)鑒定

　　下表顯示了李斯特氏菌種間的血清學(xué)關(guān)系。

李斯特氏菌的血清學(xué)關(guān)系

 

種別	血清型
單增李斯特氏菌	1/2A、1/2B、1/2C、3A、3B、3C、4A、4AB、4B、4C、4D、4E、“7”
綿羊李斯特氏菌	5
英諾克李斯特氏菌	4AB、6A、6B、Un（未確定）
威爾李斯特氏菌	6A、6B
西爾李斯特氏菌	1/2B、4C、4D、6B、Un（未確定）

 

 

　　將TSBYE肉湯培養(yǎng)物接種到3mLTSBYE肉湯中，35℃培養(yǎng)24h，接種2支TSAYE瓊脂斜面，35℃培養(yǎng)24h。用3mL0.01mol/l磷酸鹽緩沖液將斜面菌苔洗下，菌懸液于80℃水浴中加熱1h，以2500r/min離心30，棄去2mL上清夜，將剩余液與沉淀混勻制成菌懸液，進(jìn)行血清學(xué)玻片凝集試驗(yàn)。

5、小鼠毒力試驗(yàn)

　　將分離的菌株接種到10 mL TSBYE肉湯中，35℃培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)物離心、濃縮，用1mL生理鹽水制成菌懸液（濃度為10¹⁰個(gè)菌/mL），取0.1mL腹腔注射體重為16-18g 小鼠，每組5個(gè)觀察7d內(nèi)小鼠死亡情況。用已知致病的單增李斯特氏菌和非致病的英諾克李斯特氏菌相同方法進(jìn)行，做對(duì)照試驗(yàn)。

6、協(xié)同溶血（CAMP）試驗(yàn)

　　在羊血瓊脂平板上平行接種β-溶血金黃色葡萄球菌（S.aureus）和馬紅球菌(R.equi),在它們中間垂直劃線接種可疑菌，與兩線相近但不相交，在30℃培養(yǎng)24h-48h,檢查平板中垂直接種點(diǎn)對(duì)溶血環(huán)的影響�？拷�金黃色葡萄球菌接種點(diǎn)的單增李斯特氏菌的溶血增強(qiáng)，西爾李斯特氏菌的溶血也增強(qiáng)，綿羊李斯特氏菌在馬紅血球附近的溶血增強(qiáng)。

（二）控制

　　單增李斯特氏菌在一般熱加工處理中能存活，熱處理已殺滅了競(jìng)爭(zhēng)性細(xì)菌群，使單增李斯特氏菌在沒有競(jìng)爭(zhēng)的環(huán)境條件下易于存活，所以在食品加工中，中心溫度必須達(dá)到70℃持續(xù)2分鐘以上。

　　單增李斯特氏菌在自然界中廣泛存在，所以即使產(chǎn)品已經(jīng)過熱加工處理充分滅活了單增李斯特氏菌，但有可能造成產(chǎn)品的二次污染，因此蒸煮后防止二次污染是極為重要的。

　　由于單增李斯特氏菌在4℃下仍然能生長(zhǎng)繁殖，所以未加熱的冰箱食品增加了食物中毒的危險(xiǎn)。冰箱食品需加熱后再食用。