當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查時(shí)，應(yīng)進(jìn)行控制菌檢查方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的的控制菌檢查方法測(cè)定。若藥品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，檢驗(yàn)方法應(yīng)進(jìn)行重新驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)也可與供試品的控制菌檢查同時(shí)進(jìn)行。

1.3.1.驗(yàn)證用菌株 

大腸埃希菌（Esherichia coli）【CMCC(B) 44102】

金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus）【CMCC(B)26003】

乙型副傷寒沙門(mén)菌（Salmonella paratyphi B）【CMCC(B) 50094】

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）【CMCC (B) 10104】

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用的菌株傳代次數(shù)不得超過(guò)5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。  

1.3.2.菌液制備 

大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門(mén)菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)；分別取培養(yǎng)液 1ml加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5~10-7，制成每1ml含菌數(shù)10～100cfu的菌懸液。   

1.3.3. 陰性菌對(duì)照組

設(shè)立陰性菌對(duì)照組是為了驗(yàn)證該控制菌檢查方法的專(zhuān)屬性。方法同試驗(yàn)組，驗(yàn)證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門(mén)菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌采用金黃色葡萄球菌；驗(yàn)證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌采用大腸埃希菌。陰性對(duì)照菌不得檢出。  

1.3.4.試驗(yàn)組

1.3.4.1.常規(guī)法

◆ 大腸埃希菌 取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽(yáng)性菌對(duì)照加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對(duì)照加入金黃色葡萄球菌 10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，取此培養(yǎng)物按《微生物限度檢查SOP》大腸埃希菌項(xiàng)下規(guī)定檢查。

◆大腸菌群 取含適量（不少于10ml）的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入含供試品1g或1ml 、0.1g或0.1ml、含供試品0.001g或0.001ml的供試液，陽(yáng)性菌對(duì)照加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對(duì)照加入金黃色葡萄球菌 10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，按《微生物限度檢查SOP》大腸菌群項(xiàng)下規(guī)定檢查。

◆沙門(mén)氏菌 取供試品10g或10ml，直接或處理后接種至適量（不少于200ml）的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，陽(yáng)性菌對(duì)照加入沙門(mén)菌 10～100cfu，陰性菌對(duì)照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。按《微生物限度檢查SOP》沙門(mén)菌項(xiàng)下規(guī)定檢查。

◆銅綠假單胞菌 取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽(yáng)性菌對(duì)照加入銅綠假單胞菌10～100cfu，陰性菌對(duì)照加入大腸埃希菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。按《微生物限度檢查SOP》沙門(mén)菌項(xiàng)下規(guī)定檢查。 

◆ 金黃色葡萄球菌 取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽(yáng)性菌對(duì)照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，陰性菌對(duì)照加入大腸埃希菌 10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。按《微生物限度檢查SOP》金黃色葡萄球菌項(xiàng)下規(guī)定檢查。

1.3.4.2. 培養(yǎng)基稀釋法 供試品有抑菌作用，放大培養(yǎng)基量，由1：100放大到1：300、1：500或1：1000，由于容器體積限制，一般放大到500ml或1000ml，本法適用于抑菌作用不強(qiáng)的樣品。

1.3.4.3. 薄膜過(guò)濾法 采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，取規(guī)定量供試液，過(guò)濾，沖洗，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過(guò)濾后，注入培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。 

1.3.4.4. 離心沉淀集菌法 取規(guī)定量供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3~5分鐘，取全部上清液，再以3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取下面1ml液體，并將適量的稀釋劑洗滌管底的洗滌液一并移入同瓶增菌液中，培養(yǎng)，本法適用于中度抑菌作用的樣品。 

1.3.4.5.中和法 在供試品溶液中加入相應(yīng)的中和劑，以減除供試品中抑菌成分的作用，中和劑應(yīng)對(duì)微生物無(wú)毒性，與抑菌成分結(jié)合后的產(chǎn)物應(yīng)對(duì)微生物亦無(wú)毒性，或有毒性但不影響待檢菌的檢出。  

1.3.5.結(jié)果判斷 

至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立平行試驗(yàn)。陰性菌對(duì)照組不得檢出陰性對(duì)照菌。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，照該供試液制備方法和控制菌檢查法進(jìn)行該供試品控制菌的檢查；若試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過(guò)濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。 

2.驗(yàn)證的實(shí)施 

2.1細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證記錄及控制菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證記錄(見(jiàn)附件)。

2.2.分析數(shù)據(jù)，綜合整個(gè)驗(yàn)證過(guò)程，得出驗(yàn)證結(jié)論。 

2.3.驗(yàn)證過(guò)程中發(fā)生的異常情況，按照《偏差處理程序》進(jìn)行處理。 

3.相關(guān)文件

《微生物限度檢查SOP》

4.再驗(yàn)證

4.1.藥品的組分發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)。 

4.2.驗(yàn)證時(shí)檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)。