基本原理

玫瑰花環(huán)試驗是體外檢測人和動物細(xì)胞免疫功能的一種方法。E—玫瑰花環(huán)試驗是T淋巴細(xì)胞計數(shù)的一種重要方法。由于人和動物的T淋巴細(xì)胞表面有紅細(xì)胞受體，因此紅細(xì)胞可以粘附到T淋巴細(xì)胞的周圍而形成玫瑰花樣的細(xì)胞團(tuán)。在紅細(xì)胞中，以綿羊紅細(xì)胞最為常用。B淋巴細(xì)胞則沒有紅細(xì)胞受體，所以不能形成E—玫瑰花環(huán)，以資鑒別。

材料與試劑

1．肝素抗凝劑

2．淋巴細(xì)胞分層液 配制方法見細(xì)胞分離技術(shù)。

3．無Ca2 、Mg2 Hank’s液

NaCl 4.00g

NaHCO3 0.175g

KCl 0.20g

Na2HPO4.12H2O 0.076g

KH2PO4 0.030g

葡萄糖 0.50g

H2O加至 500.00ml

用5.6％NaHCO3調(diào)pH至7.2，115℃15min滅菌。4℃貯藏備用。

4．5.6％NaHCO3液

NaHCO3 5.60g

H2O 100.00ml

115℃20min滅菌, 4℃貯藏備用。

5．0.8％戊二醛溶液

25％戊二醛溶液 0.32ml

Hank’s液 9.68ml

用前配制。

6．Giemsa—weight染色液

Giemsa粉 0.03g

Weight粉 0.30g

甲醇 100.00ml

先將染料一起放入研缽內(nèi)，加入少量甲醇，研磨細(xì)，然后倒入瓶內(nèi)，并用甲醇沖洗研缽內(nèi)染料，一起倒入玻瓶內(nèi)，補(bǔ)足甲醇量，備用。

操作方法

1．取肝素抗凝血2ml，置37℃水浴自然沉淀30min～40min，吸取全部血漿（約1ml）。

2．于血漿中加Hank’s液數(shù)毫升，洗滌，1 500r/min離心5min～10min，棄上清。重復(fù)洗滌4次，沉淀均勻即為淋巴細(xì)胞懸液。

3．采綿羊肝素抗凝血，加數(shù)倍Hank’s液，洗滌3次，最后以Hank’s配成10％懸液，4℃保存。

4．取0.1ml淋巴細(xì)胞懸液，加10％紅血球懸液0.1ml，加小牛血清0.1ml。

5．37℃水浴10min，低速離心（600r/min）5min。

6．吸棄多余的上清液后，放入4℃冰箱2h～4h。

7．取出后，將沉淀輕輕搖起，加0.8％戊二醛0.1ml，混勻后4℃固定15min。

8．將干凈的玻片用Hank’s液沾濕，滴一小滴混懸液，讓其自然散開即可。

9．自然干燥后，用姬姆薩—瑞氏液（Giomsa—weight）或蘇木精—伊紅染色，水洗，干燥鏡檢。

結(jié)果判定

凡一個淋巴細(xì)胞結(jié)合3個或3個以上的紅細(xì)胞者為一個E—玫瑰環(huán)。檢查200個淋巴細(xì)胞，計算其玫瑰花環(huán)形成率。

注意事項

1．影響E—玫瑰花環(huán)試驗最主要的因素淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞的新鮮程度，被檢血樣必須新鮮，無菌，采血后要求在3h～4h內(nèi)進(jìn)行檢驗，否則由于淋巴細(xì)胞的死亡，受體脫落，影響檢查結(jié)果。紅細(xì)胞用阿氏液保存最多不要超過3周，且不應(yīng)溶血。

2．控制好反應(yīng)溫度、時間等條件對玫瑰花環(huán)形成率有較大影響。選37℃作用10min，低速離心5min，置4℃ 2h～4h，其結(jié)果穩(wěn)定性較好，結(jié)合率較高。如在37℃作用時間較長，可見玫瑰花環(huán)發(fā)生變形，結(jié)合部位松弛、拉開，甚至解離。

3．指示紅血球的動物種類也與玫瑰花環(huán)的形成率有關(guān)。如馬淋巴細(xì)胞與豚鼠紅細(xì)胞結(jié)合較好，而驢則與綿羊紅血球結(jié)合較好。Melinda氏報道，人、馬、牛、豬、狗、貓、鼠與豚鼠紅細(xì)胞的結(jié)合率都高于綿羊紅細(xì)胞的結(jié)合率。

4．加犢牛血清能增加玫瑰花環(huán)形成細(xì)胞的穩(wěn)定性，增強(qiáng)與指示紅細(xì)胞結(jié)合的牢固性。

5．Hank’s液的pH以7.2～7.4為宜。