動物的選擇與免疫

　　1．動物的選擇 　純種BALB/C小鼠，較溫順，離窩的活動范圍小，體弱，食量及排污較小，一般環(huán)境潔凈的實驗室均能飼養(yǎng)成活。目前開展雜交瘤技術(shù)的實驗室多選用純種BALA/C小鼠。

　　2．免疫方案 　　選擇合適的免疫方案對于細胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般在融合前兩個月左右根據(jù)確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。

　　（1）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應(yīng)先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑。

　　初次免疫 抗原1～50μg加福氏完全佐劑皮下多點注射或脾內(nèi)注射（一般0.8～1ml,0.2ml/點）

　　↓3周后

　　第二次免疫 劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip（腹腔內(nèi)注射）（ip劑量不宜超過0.5ml）

　　↓3周后

　　第三次免疫 劑量同一，不加佐劑，ip（5～7天后采血測其效價）

　　↓2～3周

　　加強免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv（靜脈內(nèi)注射）

　　↓3天后

　　取脾融合

　　目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如：①將可溶性抗原顆粒化或固相化，一方面增強了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細胞因子作為佐劑，提高機體的免疫應(yīng)答水平，增強免疫細胞對抗原的反應(yīng)性。

　�。�2）顆�？乖�免疫性強，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細胞性抗原為例，免疫時要求抗原量為1～2×107個細胞。

　　初次免疫 1×107/0.5ml ip

　　↓2～3周后

　　第二次免疫 1×107/0.5ml ip

　　↓3周后

　　加強免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv

　　↓

　　取脾融合

細胞融合

　　1．細胞融合前準(zhǔn)備

　�。�1）骨髓瘤細胞系的選擇：骨髓瘤細胞應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。常用的骨髓瘤細胞系見表2-4。

表2-4用于融合試驗的主要骨髓瘤細胞系

　　骨髓瘤細胞的培養(yǎng)可用一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10%～20%，細胞濃度以104～5×105/ml為宜，最大濃度不得超過106/ml。當(dāng)細胞處于對數(shù)生長的中期時，可按1：3～1：10的比例傳代。每3～5天傳代一次。細胞在傳代過程中，部分細胞可能有返祖現(xiàn)象，應(yīng)定期用8-氮鳥嘌呤進行處理，使生存的細胞對HAT呈均一的敏感性。

　�。�2）飼養(yǎng)細胞：在組織培養(yǎng)中，單個或少數(shù)分散的細胞不易生長繁殖，若加入其它活細胞，則可促進這些細胞生長繁殖，所加入的這種細胞數(shù)被稱為飼養(yǎng)細胞。在制備McAb的過程中，許多環(huán)節(jié)　需要加飼養(yǎng)細胞，如在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞（較為常用）、小鼠脾臟細胞或胸腺細胞。也有人用小鼠成纖維細胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細胞。飼養(yǎng)細胞的量為一般為2×104或105細胞/孔。

　　2．細胞融合的步驟

　�。�1）制備飼養(yǎng)細胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細胞。

　　與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周

↓

　　拉頸 處死，浸泡在75%酒精內(nèi)，3～5min

　　↓

　　用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜

　　↓

　　用無菌注射器注入5～6ml預(yù)冷的培養(yǎng)液（嚴禁刺破腸管）

　　↓

　　反復(fù)沖洗，吸出沖洗液

　　↓

　　沖洗液放入10ml離心管，1200rpm/分離5～6min

　　↓

　　用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細胞數(shù)至1×105/ml

　　↓

　　加入96孔板，100μl/孔

　　↓

　　放入37。c CO2孵箱培養(yǎng)

　�。�2）制備免疫脾細胞

　　最后一次加強免疫3天后小鼠拉頸處死

　　↓

　　無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗 一次

　　↓

　　脾臟研碎，過不銹鋼篩網(wǎng)

　　↓

　　離心，細胞用培養(yǎng)液洗2次

　　↓

　　計數(shù)

　　↓

　　取108脾淋巴細胞懸液備用

　�。�3）制備骨髓瘤細胞

　　取對數(shù)生長骨髓瘤細胞離心

　　↓

　　用無血清培養(yǎng)液洗2次

　　↓

　　計數(shù)，取得×107細胞備用

　�。�4）融合

　�、賹⒐撬枇黾毎�與脾細胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養(yǎng)液洗1次，離心，1200rpm,8min;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略松動。

　�、�90s內(nèi)加入37℃預(yù)溫的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動。37℃水浴作用90s。

　　③加37。C預(yù)溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。

　　④離心，800rpm, 6min。

　　⑤充上清，用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸。

　�、迣⑸鲜黾毎�，加到已有飼養(yǎng)細胞層的96孔板內(nèi)，每孔加100μl。一般一個免疫脾臟可接種4塊96孔板。

　　⑦將培養(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

選擇雜交瘤細胞及抗體檢測

　　1．HAT選擇雜交瘤細胞 　　　脾細胞和骨髓瘤細胞經(jīng)PEG處理后，形成多種細胞的混合體，只有脾細胞與骨髓細胞形成的雜交瘤細胞才有意義。在HAT選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時，由于骨髓瘤細胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶，故不能生長繁殖，而雜交瘤細胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養(yǎng)液可以生長繁殖。

　　在用HAT選擇培養(yǎng)1～2天內(nèi)，將有大量瘤細胞死亡，3～4天后瘤細胞消失，雜交細胞形成小集落，HAT選擇培養(yǎng)液維持7～10天后應(yīng)換用HT培養(yǎng)液，再維持2周，改用一般培養(yǎng)液。在上述選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細胞布滿孔底1/10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。在選擇培養(yǎng)期間，一般每2～3天換一半培養(yǎng)液。

　　2．抗體的檢測　　 檢測抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。

　　常用的方法有：（1）放射免疫測定（RIA）可用于可溶性抗原、細胞McAb的檢測。（2）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）可用于可溶性抗原、細胞和病毒等McAb的檢測。（3）免疫熒光試驗適合于細胞表面抗原的McAb的檢測。（4）其它如間接血凝試驗、細胞毒性試驗、旋轉(zhuǎn)粘附雙層吸附試驗等。

雜交瘤的克隆化

　　雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。因為經(jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內(nèi)只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數(shù)個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞、所需要的抗體（特異性抗體）分泌細胞和其它無關(guān)抗體的分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開就需要克隆化�？寺』�的原則是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結(jié)果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。

　　克隆化的方法很多，最常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。

　　1．有限稀釋法克隆

　　（1）克隆前1天制備飼養(yǎng)細胞層（同細胞融合）。

　　2）將要克隆的雜交瘤細胞從培養(yǎng)孔內(nèi)輕輕吹干，計數(shù)。

　�。�3）調(diào)整細胞為3～10個細胞/ml。

　�。�4）取頭天準(zhǔn)備的飼養(yǎng)細胞層的細胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中 。

　�。�5）在第7天換液，以后每2～3天換液1次。

　�。�6）8～9天可見 細胞克隆形成，及時檢測抗體活性。

　�。�7）將陽性孔的細胞移至24孔板中擴大培養(yǎng)。

　�。�8）每個克隆應(yīng)盡快凍存。

　　2．軟瓊脂培養(yǎng)法克隆

　　（1）軟瓊脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640。

　�、�1%瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預(yù)熱。

　　②0.5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42℃保溫。

　�。�2）用上述0.5%瓊脂液（含有飼養(yǎng)細胞）15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。

　�。�3）按100/ml，500/ml或5000/ml等濃度配制需克隆的細胞懸液。

　�。�4）1ml 0.5%瓊脂液（42℃預(yù)熱）在室溫中分別與1ml不同濃度的細胞懸液相混合。

　�。�5）混勻后立傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10min，使其凝固，孵育于37℃、5%CO2孵箱中。

　　（6）4～5天 后即可見針尖大小白色克隆，7～10天后，直接移種至含飼養(yǎng)細胞的24孔中進行培養(yǎng)。

　　（7）檢測抗體，擴大培養(yǎng)，必要是地再克隆化。

雜交瘤細胞的凍存與復(fù)蘇

　　1．雜交瘤細胞的凍存　　 及時凍存原始孔的雜交瘤細胞每次克隆化得到的亞克隆細胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩(wěn)定分泌抗體的細胞系的時候，細胞的培養(yǎng)過程中隨時可能發(fā)生細胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。

　　雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞系的凍存方法一樣，原則上細胞應(yīng)在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)長滿孔底時，一孔就可以裝一支安瓿凍存。

　　細胞凍存液：50%小牛血清；40%不完全培養(yǎng)液；10%DMSO（二甲基亞砜）。

　　凍存液最好預(yù)冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降至0℃后放入-70℃超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可用細胞凍存裝置進行凍存。凍存細胞要定期復(fù)蘇，檢查細胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細胞可保存數(shù)年或更長時間。

　　2．細胞復(fù)蘇方法 　將玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min內(nèi)使凍存的細胞解凍，將細胞用完全培養(yǎng)液洗滌兩次，然后移入頭天已制備好的飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)細胞形成集落時，檢測抗體活性。

單克隆抗體的大量生產(chǎn)

　　大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：

　　（1）體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細胞，從一清液中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液內(nèi)抗體含量為10～60μg/ml,如果大量生產(chǎn)，費用較高。

　　（2）體內(nèi)接種雜交瘤細胞，制備腹水或血清。

　�、賹嶓w瘤法：對數(shù)生長期的雜交瘤細胞按1～3×107/ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2ml,共2～4點。待腫瘤達到一定大小后（一般10～20天）則可采血，從血清中獲得單克隆 抗體的含量可達到1～10mg/ml。但采血量有限。

　�、诟顾�的制備：常規(guī)是先腹腔注射0.5ml Pristane (降植烷)或液體石蠟于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞7～10天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達到5～10mg/ml，這是目前最常用的方法，還可將腹水中細胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水塊、量多。

單克隆抗體的鑒定

　　對制備的McAb進行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的，應(yīng)做下述幾個方面的鑒定：

　　1．抗體特異性的鑒定 　　除用免疫原（抗原）進行抗體的檢測外，還應(yīng)該用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA法。例如：①制備抗黑色素瘤細胞的McAb，除用黑色素瘤細胞反應(yīng)外，還應(yīng)該用其它臟器的腫瘤細胞和正常細胞進行交叉反應(yīng)，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。②制備抗重組的細胞因子的單克隆抗體，應(yīng)首先考慮是否與表達菌株的蛋白有交叉反應(yīng)，其次是與其它細胞因子間有無交叉。

　　2．McAb的Ig類與亞類的鑒定　　一般在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體進行篩選時已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴或夾心ELISA來確定。在作雙擴試驗時，如加入適量的PEG（3%），更有利于沉淀線的形成。

　　3．McAb中和活性的鑒定 　　　用動物或細胞的保護實驗來確定McAb的生物學(xué)活性。例如，如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時接種于易感的動物或敏感的細胞，來觀察動物或細胞是否得到抗體的保護。

　　4．McAb識別抗原表位的鑒定　　用競爭結(jié)合試驗，測相加指數(shù)的方法，測定McAb所識別抗原位點，來確定McAb的識別的表位是否相同。

　　5．McAb親合力的鑒定　 用ELISA或RIA競爭結(jié)合試驗來確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親合力。