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腐敗希瓦氏菌導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗的原因探析

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期：2013-08-28  來源：食品安全導(dǎo)刊
核心提示：從鱈魚表皮和內(nèi)臟的混合菌群中分離純化出能夠穩(wěn)定代謝氧化三甲胺（TMAO）的腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）Y0612。使用非抑制性離子色譜對腐敗希瓦氏菌代謝TMAO 的能力進(jìn)行了分析，研究菌株對TMAO 的代謝規(guī)律。
 腐敗希瓦氏菌導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗的原因探析

摘　要：從鱈魚表皮和內(nèi)臟的混合菌群中分離純化出能夠穩(wěn)定代謝氧化三甲胺（TMAO）的腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）Y0612。使用非抑制性離子色譜對腐敗希瓦氏菌代謝TMAO 的能力進(jìn)行了分析，研究菌株對TMAO 的代謝規(guī)律。確定Y0612 對TMAO 的還原沒有受氧氣的抑制，在有氧條件下比厭氧條件下對TMAO 還原效果更好；溫度為15~35℃之間TMAO 的代謝率隨著溫度升高而略有升高。在水產(chǎn)品的加工中，通過SSOP 保持衛(wèi)生的操作，減少與氧氣的接觸，對環(huán)境溫度進(jìn)行控制， 對于該菌均有一定的抑制作用，減少水產(chǎn)品的腐敗。

關(guān)鍵詞：腐敗希瓦氏菌 氧化三甲胺 代謝 腐敗 水產(chǎn)品

氧化三甲胺 (trimethylamine-N-oxide，TMAO) 分子式為 (CH3)3NO，廣泛分布于海產(chǎn)硬骨魚類的肌肉中[1]，是許多海洋魚類的肌肉中非蛋白氮的重要組成部分，具有特殊的鮮味[2]。在貯藏及運(yùn)輸過程中，TMAO 在環(huán)境微生物和水產(chǎn)品自身內(nèi)源性酶的作用下[3]，降解產(chǎn)生三甲胺（TMA），進(jìn)而生成二甲胺（DMA）和甲醛（FA）等[4]。

三甲胺是海洋魚類腐敗的惡臭成分[5]，在海產(chǎn)魚類加工過程中排放的高濃度廢水中含量十分豐富[6~7]。三甲胺具有毒副作用，會(huì)抑制大分子（如DNA、RNA 和蛋白質(zhì)）的合成，對動(dòng)物胚胎具有致畸作用[8]。二甲胺具有魚腐臭的特殊氣味，是城市污水的主要臭源之一。
甲醛可與蛋白質(zhì)、氨基酸結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性，使魚肉質(zhì)構(gòu)變差、疏水性增加，導(dǎo)致魚肉質(zhì)量變差甚至變質(zhì)。甲醛嚴(yán)重干擾人體細(xì)胞正常代謝，對細(xì)胞具有極大傷害作用，已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織確定為致癌物質(zhì)，能引起各種癌癥，特別是白血病[9~10]。目前水產(chǎn)品中的甲醛問題已成為全球公共衛(wèi)生關(guān)注的焦點(diǎn)，并被列入國家食品安全戰(zhàn)略研究的重點(diǎn)。很多人認(rèn)為水產(chǎn)品甲醛來源于外源性添加，實(shí)際上，有相當(dāng)量的甲醛是水產(chǎn)品自身的微生物代謝產(chǎn)生的。在儲(chǔ)藏過程( 包括冷藏和冷凍) 中，水產(chǎn)品在酶和微生物的作用下可產(chǎn)生甲醛。甲醛生成受到多種因素的影響，包括冷藏狀態(tài)、冷藏溫度、添加物質(zhì)、加工工藝等[11~16]。
本文對能夠穩(wěn)定代謝氧化三甲胺（TMAO）的細(xì)菌Y0612 進(jìn)行了研究，最終確定該菌為腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens），利用非抑制性離子色譜對其代謝TMAO 的能力進(jìn)行了分析，對細(xì)菌的TMAO 代謝規(guī)律進(jìn)行了研究。
1 材料與方法
1.1 材料、試劑與儀器
1.1.1 材料：新鮮太平洋真鱈，購于青島市齊東路水產(chǎn)品市場。
1.1.2 試劑：氧化三甲胺(AR)，三甲胺溶液(AR)，二甲胺溶液(AR)，成都市科龍化工試劑廠；3mmol/L 甲烷磺酸溶液（GR）， 美國安捷倫公司。

1.1.3 培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨5，酵母膏1，NaCl 15，F(xiàn)eCl3 0.01， pH7.2~7.5，121℃滅菌20min；TMAO 經(jīng)0.22μm 濾膜過濾后按2.0 mg/ml 的終濃度添加。Biolog 培養(yǎng)基成分參照謝家儀[17]。

1.1.4 儀器：DL-CJ-2N 高性能無菌實(shí)驗(yàn)臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造廠；空氣浴振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；離子色譜檢測儀IC2000，美國安捷倫公司；722S 分光光度計(jì)，上海浦東物理光學(xué)儀器廠；SK-1 快速混勻器，常州精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LDZX-40BI 型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。
1.2 穩(wěn)定代謝TMAO 菌株的獲取與菌種鑒定
1.2.1 菌株的獲取

超凈臺(tái)上，取鱈魚表皮和內(nèi)臟適量，經(jīng)無菌研缽研磨后， 置于含100ml 無菌生理鹽水的三角瓶內(nèi)，170r/min，25℃振蕩培養(yǎng)1h。取10ml 上述菌體原液，接種到含有100ml 富集培養(yǎng)基的錐形瓶中，170r/min，25℃振蕩培養(yǎng)24h。梯度稀釋上述培養(yǎng)液，涂布平板后，在適宜條件下培養(yǎng)24h，依據(jù)平板的菌落數(shù)，選恰當(dāng)稀釋度且生長狀況良好的菌為對象，進(jìn)行菌種的分離。選取不同特性的菌落，進(jìn)行多次反復(fù)的劃線培養(yǎng)，直至菌種純化。

1.2.2 菌株代謝TMAO 能力的檢測
采用非抑制性離子色譜進(jìn)行檢測，參考郭修娟[18] 方法。
1.3 影響細(xì)菌TMAO 代謝因素的研究
1.3.1 氧氣對細(xì)菌代謝TMAO 的影響

取菌株種子液5ml 接種到250ml 三角瓶中，瓶內(nèi)添加100ml 含TMAO 2.0 mg/ml 的2216E 培養(yǎng)基，分別采用170r/ min 振蕩培養(yǎng)和靜置培養(yǎng)的方法分析有氧和厭氧條件下細(xì)菌的代謝能力，培養(yǎng)溫度25℃，每隔2h 取樣一次，按照1.2.2 方法進(jìn)行檢測；同時(shí)用分光光度計(jì)在660nm 處測吸光值，作為菌株生物量測定的參考值。

1.3.2 溫度對細(xì)菌代謝TMAO 的影響

取Y0612 種子液5ml 接種到100ml 含TMAO 2.0 mg/ ml 的培養(yǎng)基中，分別于15℃、25℃、35℃，170r/min，振蕩培養(yǎng)24h，每隔一定時(shí)間取樣，按照1.2.2 方法進(jìn)行檢測；同時(shí)測定菌液660nm 的吸光值。

2 結(jié)果與分析
2.1 菌株的TMAO 代謝能力

根據(jù)菌株代謝TMAO 的離子色譜分析結(jié)果，做出發(fā)酵24h 時(shí)TMA 與TMAO 的含量變化曲線，如圖1 所示。

發(fā)酵進(jìn)行4h 時(shí)，非抑制型離子色譜檢測到了TMA 的產(chǎn)生， 進(jìn)行24h 時(shí)TMAO 含量已產(chǎn)生較大幅度的下降，降解率相當(dāng)于初始含量的70%。

2.2 影響因素分析
2.2.1 氧氣對細(xì)菌代謝TMAO 的影響
腐敗希瓦氏菌Y0612 為兼性厭氧菌，氧氣的存在能夠有效促進(jìn)菌株的生長。在有氧與厭氧條件下，前4h 菌株對TMAO 的代謝基本一致，10h 后，有氧條件下TMAO 代謝速率平穩(wěn)上升，厭氧條件下增長緩慢（圖2）。由于反應(yīng)開始時(shí)，培養(yǎng)基中有一定量的溶解氧，一段時(shí)間后這部分氧消耗完畢，達(dá)到完全厭氧的狀態(tài)。TMAO 在生長對數(shù)期被還原為TMA( 圖3）。

2.2.2 溫度對細(xì)菌代謝TMAO 的影響

對腐敗希瓦氏菌在15℃、25℃、35℃條件下培養(yǎng)24h 后， 對發(fā)酵液中細(xì)菌生物量和TMAO、TMA 含量的檢測結(jié)果分別如圖4 和圖5 所示。溫度為15℃ ~35℃之間TMAO 的代謝率基本上隨著溫度升高而略有升高。

                                                        A

3 討論
引起海水魚類及制品中甲醛超標(biāo)的原因除了不法分子的外源添加外，更主要的是某些海產(chǎn)品含有的氧化三甲胺能夠在微生物和自身內(nèi)源性酶的作用下產(chǎn)生甲醛；此外，一些加工過程如高溫[19] 或添加劑[20] 等非酶途徑也會(huì)導(dǎo)致海水魚中甲醛含量的增高。目前，在水產(chǎn)品中TMAO 的代謝方面的研究側(cè)重于內(nèi)源性的氧化三甲胺酶(TMAOase) [21]，這是一類可以將TMAO 分解為DMA 和FA 的酶系統(tǒng)，而在關(guān)于由微生物引起的水產(chǎn)品腐敗及其對三甲胺、二甲胺和甲醛產(chǎn)生所起的作用方面的研究則相對較少[22]。TMAO 還原酶（TMAO reductase）是一類存在于某些微生物體內(nèi)能夠代謝TMAO 的酶，其催化作用是將TMAO 降解為TMA[23]。TMAO 還原酶催化TMAO 還原，參與菌的呼吸產(chǎn)能過程，需要一系列的電子供體等組成成分 [24]，甲酸鹽、細(xì)胞色素、FMN 和NADH 都可以作為TMAO 還原酶催化TMAO 還原的電子中間傳遞物質(zhì)[25]。這種氧化三甲胺還原酶已在許多海洋細(xì)菌、淡水池塘光合細(xì)菌和腸道細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)。
從鱈魚體表和內(nèi)臟混合菌群分離純化到的菌株Y0612 通過非抑制性離子色譜分析，證明其有代謝TMAO 的能力，代謝產(chǎn)物為TMA，說明該菌株能夠產(chǎn)生氧化三甲胺還原酶。通過16S rDNA 序列分析和進(jìn)化樹的構(gòu)建及Biolog 生物鑒定法得出結(jié)論，該菌株為腐敗希瓦氏菌。該菌株在有氧和無氧條件下均具有還原TMAO 的能力，對魚肉的腐敗具有促進(jìn)作用。在水產(chǎn)品的加工中，通過SSOP 保持衛(wèi)生的操作，減少與氧氣的接觸，對環(huán)境溫度進(jìn)行控制，對于該菌均有一定的抑制作用，可減少水產(chǎn)品的腐敗。本研究為對水產(chǎn)品在儲(chǔ)存加工過程中防止腐敗和保持良好的鮮度，為水產(chǎn)加工廢水惡臭控制以及對水產(chǎn)品內(nèi)源性甲醛產(chǎn)生途徑和機(jī)理的闡明及其有效控制提供了一定的理論依據(jù)。
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